孤獨(dú)癥相關(guān)基因NRXN3β啟動(dòng)子區(qū)域的研究.pdf

1、目的:確定 NRXN3β基因中具有啟動(dòng)子活性功能的區(qū)域,并限定最小的啟動(dòng)子區(qū)域范圍,尋找具有調(diào)控NRXN3β基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的順式作用元件所在區(qū)域,證實(shí)順式元件中對啟動(dòng)子活性起主要作用的核心堿基。
　　方法:分別構(gòu)建涵蓋Genbank數(shù)據(jù)庫里NRXN3β基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約1500bp、下游約300bp的NRXN3β基因啟動(dòng)子正向序列和反向序列-熒光素酶報(bào)告基因載體。將人胚腎細(xì)胞HEK293用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法培養(yǎng)后，使用自Invi

2、trogen公司購得的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，將構(gòu)建的兩個(gè) NRXN3β基因啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染48孔板培養(yǎng)的 HEK293并使其在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出熒光素酶。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行裂解，細(xì)胞裂解液中的熒光素酶活性使用 Promega公司購得的雙熒光素酶檢測試劑（E1910）進(jìn)行測定，在同批次轉(zhuǎn)染的內(nèi)參pGL4.10載體的熒光素酶活性校準(zhǔn)后，用最終活性的比值反應(yīng) NRXN3β基因的啟動(dòng)子活性，確定NRXN3β基因序

3、列NRXN3β-1445/+302E具有啟動(dòng)子活性。然后在該段序列基礎(chǔ)上進(jìn)行5’端刪切和3’端刪切并構(gòu)建相應(yīng)的啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告載體比較熒光素酶活性的差異，發(fā)現(xiàn)了 NRXN3β基因中具有啟動(dòng)子活性兩個(gè)最小區(qū)域 NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E，并確定對啟動(dòng)子活性起調(diào)控作用的順式作用元件所存在的序列NRXN3β-110/-80。最后分別以p4NRXN3β-543/+117E、p4NRXN3β-100/+1

4、17E和 p4NRXN3β-110/+117E為模版，使用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在序列 NRXN3β-110/-80中進(jìn)行堿基突變并比較熒光素酶活性，確定了對啟動(dòng)子活性有重要作用的順式作用元件中的核心堿基。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了涵蓋不同區(qū)域序列的NRXN3β基因啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)告載體，最長插入序列片段長1747bp，包含NRXN3β基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1445bp到下游302bp的序列。繼續(xù)刪切NRXN3β-1445/+302E的5

5、’端及3’端并轉(zhuǎn)染HEK293，發(fā)現(xiàn)序列中存在一系列影響啟動(dòng)子活性的激活區(qū)域及抑制區(qū)域,同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)序列NRXN3β-543/-121E及NRXN3β-50/+117E這兩個(gè)序列中均可能含有啟動(dòng)子最小活性區(qū)域。在啟動(dòng)子 NRXN3β-50/+117E的5’端刪切發(fā)現(xiàn)-110/-80區(qū)域可能包含調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的順式作用元件，并對NRXN3β的啟動(dòng)子活性可能起關(guān)鍵作用。通過對序列-110/-90的堿基進(jìn)行基因定點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)，位于-107/-1

6、05、-101/-99、-98/-95的堿基是順式作用元件中的核心堿基。對比數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)-110/-80序列是一段高GC含量區(qū)域，存在多個(gè)候選轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)論：通過實(shí)驗(yàn)我們成功找到了包含 NRXN3β基因啟動(dòng)子的兩個(gè)最小區(qū)域NRXN3β-543/-121E和NRXN3β-50/+117E，并確定對啟動(dòng)子活性起主要作用的序列NRXN3β-110/-80，該序列中存在調(diào)控啟動(dòng)子活性的順式作用元件，確定了順式作用元件中的核心