孤獨癥相關(guān)基因NRXN2β的啟動子識別及mRNA序列的5’UTR區(qū)對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用.pdf

1、第一部分研究48孔板邊緣效應(yīng)對熒光素酶報告基因?qū)嶒灥挠绊?br>　　目的：
　　觀察48孔板的邊緣孔對熒光素酶報告基因試驗結(jié)果的影響。
　　方法：
　　用常規(guī)方法培養(yǎng)人胚腎細胞HEK293，運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin2000（Invitrogen公司）將熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL4.13Z和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染入48孔板中的HEK293細胞。轉(zhuǎn)染后24h用熒光素酶報告基因試驗檢測細胞的熒光素酶活性

2、，觀察邊緣孔的邊緣效應(yīng)對熒光素酶活性的影響，及內(nèi)參海腎熒光素酶校準后的相對熒光素酶活性的影響，通過細胞計數(shù)來觀察此種差異是否由于細胞數(shù)目的不同所致。在此基礎(chǔ)上，尋找可能減小邊緣效應(yīng)的方法，如：細胞種植入48孔板時室溫靜置、48孔板重疊、空置邊緣孔。
　　結(jié)果：
　　使用48孔培養(yǎng)板進行熒光素酶報告基因?qū)嶒灤嬖谶吘壭?yīng)，邊緣孔與中間孔的測定值有顯著的差異且有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而邊緣效應(yīng)對細胞數(shù)目并沒有影響。細胞種植入

3、48孔板后，先室溫靜置1.5h、或重疊一個48孔板、或空置邊緣孔都不能減弱邊緣效應(yīng)；將48孔板的邊緣24個孔填充液體（1*PBS、ddH20、培養(yǎng)基），可以削弱邊緣效應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　熒光素酶報告基因?qū)嶒炇褂?8孔板會發(fā)生邊緣效應(yīng)。48孔板邊緣24個孔填充相應(yīng)的液體可以削弱邊緣效應(yīng)。
　　第二部分孤獨癥相關(guān)基因NRXN2β的啟動子識別及mRNA序列的5’UTR對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用
　　目的：
　　尋找

4、NRXN2β基因的啟動子和探究5’UTR對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用。
　　方法：
　　應(yīng)用生物信息學尋找NRXN2β基因的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）及上游調(diào)控區(qū)域，設(shè)計 PCR引物，以HEK293 DNA為模板，用DNA聚合酶進行擴增，將PCR產(chǎn)物和PGL4.10載體進行雙酶切、鏈接，最終得到含有不同區(qū)域的NRXN2β基因啟動子-熒光素酶報告基因質(zhì)粒。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將NRXN2β基因的熒光素酶報告

5、基因質(zhì)粒與內(nèi)參海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到HEK293細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染后24小時收細胞。用雙熒光素酶檢測試劑（Promega）測定細胞的熒光素酶活性并用內(nèi)參照進行校準，最終螢火蟲熒光素酶活性（Fluc）/海腎熒光素酶活性（Rluc）的比值反映NRXN2β基因啟動子-熒光素酶報告基因載體的活性，比較不同報告基因載體間活性的差異,確定NRXN2β基因的啟動子功能區(qū)域。將NRXN2β基因的5’UTR區(qū)插入載體pL4promoter的啟動子后

6、面，從而研究5’UTR區(qū)對蛋白質(zhì)合成的調(diào)控作用，通過質(zhì)粒的刪切確定具體的功能區(qū)域。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建一系列含有不同啟動子區(qū)域和不同5’UTR區(qū)域的NRXN2β基因熒光素酶報告基因載體，最長插入片段2065bp,包含NRXN2β第一個外顯子上游1661到下游404的序列，即P4NRXN2β-1661/+404E。刪切分析發(fā)現(xiàn)-558/-184之間含有啟動子區(qū)域。質(zhì)粒P4NRXN2β-558/+512E與P4NRXN2β