豬ATF4基因遺傳多態(tài)性及啟動子區(qū)域研究.pdf

1、脂肪是人和動物體內(nèi)必須的營養(yǎng)成分,也是構(gòu)成生物體的重要組分,其代謝調(diào)控受眾多因素的影響,主要包括遺傳因素、營養(yǎng)水平、環(huán)境因素等,它們形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)脂肪的代謝。豬作為人類動物蛋白的重要來源,其體內(nèi)脂肪的過度沉積直接影響瘦肉率的提高,因此尋找影響脂肪代謝的主效基因成為當(dāng)前動物遺傳育種專家研究的熱點(diǎn)。
　　 ATF4(activating transcription factor4)即激活轉(zhuǎn)錄因子4屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家

2、族。最近的研究發(fā)現(xiàn)其與脂肪的代謝和能量消耗有關(guān),鑒于其在脂肪代謝中的重要作用,而在豬中的研究報(bào)道較少,本文選取其作為影響豬脂肪性狀的候選基因進(jìn)行研究,探討瘦肉型和脂肪型豬差異形成的分子機(jī)制,為從分子水平上培育瘦肉率高肉質(zhì)好的豬種提供理論依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)對ATF4基因進(jìn)行克隆,遺傳效應(yīng)分析和表達(dá)模式分析,取得了如下結(jié)果:
　　 1.克隆了大白豬和梅山豬ATF4基因的CDS序列,通過測序、酶切驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在翻譯起始密碼子AT

3、G下游159bp處存在A159G轉(zhuǎn)換。
　　 2.對大白豬、長白豬、梅山豬、通城豬和大白豬×梅山豬F2進(jìn)行了AluⅠ-RFLP分析,并對大白豬×梅山豬的F2群體195個(gè)體與生產(chǎn)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果表明,ATF4的多態(tài)性與臀部平均膘厚存在極顯著相關(guān)(P<0.01),與胸腰椎間膘厚、平均膘厚、眼肌高、眼肌面積存在顯著相關(guān)(P<0.05)。
　　 3.通過RT-PCR方法對ATF4基因在心、肝、脾、肺、腎、胃等11個(gè)組織中的

4、表達(dá)量進(jìn)行定量分析,發(fā)現(xiàn)ATF4基因在肌肉中表達(dá)量較高。
　　 4.以背最長肌為材料,對ATF4基因在大白豬和梅山豬不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行了定量分析,發(fā)現(xiàn)在胚胎期65d、出生后3d在大白豬和梅山豬中基因表達(dá)量較低,兩個(gè)品種之間沒有明顯的差異,在60d和120d時(shí)期基因表達(dá)量均增加,但是梅山豬表達(dá)量顯著高于大白豬。
　　 5.通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出ATF4基因啟動子序列2007bp,并利用生物信息學(xué)在線軟件對啟動子區(qū)域的

5、順式作用元件和轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測,根據(jù)預(yù)測的結(jié)果設(shè)計(jì)缺失引物,構(gòu)建了7個(gè)含有不同長度啟動子缺失片段的雙螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。
　　 6.將構(gòu)建7個(gè)缺失片段重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PK-15和C2C12細(xì)胞,檢測雙螢光素酶的相對活性,結(jié)果構(gòu)建的載體都具有活性,其中pGL3-1280的相對活性最高在C2C12細(xì)胞中,為進(jìn)一步鑒定ATF4基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 7.對大白豬和梅山豬啟動子區(qū)域進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)存在

6、11處潛在的SNP位點(diǎn)和插入觖失,對其中一處20bp的缺失進(jìn)行了驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),在梅山豬中為缺失型,在大白豬為插入型。
　　 8.在ATG上游2540bp和2570bp處測序發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)5bp的缺失(TCTTA)和堿基突變(C/T),其中2570bp處堿基轉(zhuǎn)換可以被BstⅪ酶識別,進(jìn)行了BstⅪ-RFLP分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢查的梅山豬均為TT型,大白豬均為CC型,對136頭F2進(jìn)行酶切分型。
　　 9.克隆豬ATF4基因CDS,構(gòu)