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![2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/586e5b02-e72c-45e6-a7aa-ba226218bb08/586e5b02-e72c-45e6-a7aa-ba226218bb081.gif)
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文檔簡介
1、一、α珠蛋白基因拷貝數(shù)變異的檢測方法研究
拷貝數(shù)變異(Copynumbervariants,CNVs)是一種重要的結(jié)構(gòu)變異,可通過改變基因的劑量或影響基因表達(dá)來改變表型或?qū)е录膊?。CNV在人類基因組中的分布非常普遍,可影響基因組中超過10%的序列。然而受限于檢測手段,這類遺傳變異直到最近幾年才為研究者所重視并迅速成為當(dāng)前人類遺傳學(xué)研究的熱點。
以我們熟悉的α珠蛋白基因為例,可以看到該基因的拷貝數(shù)變異與α地中海
2、貧血(簡稱α地貧)的臨床表型間存在密切聯(lián)系。正常個體中存在4個α珠蛋白基因。當(dāng)1~4個α珠蛋白基因相繼發(fā)生缺失時,可分別導(dǎo)致以下幾種不同的臨床表型:其中1個基因缺失時為“靜止型”,沒有可檢測的臨床癥狀,無明顯血液學(xué)改變;2個基因缺失時為“標(biāo)準(zhǔn)型”,表現(xiàn)為典型的小細(xì)胞、低色素性貧血;3個基因缺失時為“中間型”,表現(xiàn)為血紅蛋白病即HbH病,有明顯的甚至嚴(yán)重的貧血癥狀,患兒從1歲左右即出現(xiàn)貧血,嚴(yán)重者肝脾腫大及黃疸,面黃肌瘦并伴骨骼變化,靠輸
3、血維持生命;4個基因都缺失時為“重型”,表現(xiàn)為致死性巴氏水腫胎綜合癥,是最嚴(yán)重的一種,生下來就是死胎或很快就死亡。除缺失外,α珠蛋白基因的重復(fù)會產(chǎn)生5個拷貝的α珠蛋白基因(αααanti3.7/αα或αααanti4.2/αα),這一額外的α珠蛋白基因會導(dǎo)致β地貧患者的臨床癥狀加重。我們通過對α珠蛋白基因拷貝數(shù)的定量來確定基因型,直接篩查出地中海貧血的高危人群。不僅如此,還可以α珠蛋白基因為模型,探索出一種適用于其它靶基因位點拷貝數(shù)檢測
4、的通用方法,以滿足目前對CNV-疾病間關(guān)系研究的需要。
近年來,多種基于芯片的高通量方法用于識別全基因范圍內(nèi)的CNV,如芯片比較基因組雜交(Arraycomparativegenomichybridization,ArrayCGH)、SNP分型芯片(SNPgenotypingarrays)以及深度測序方法(Deepsequencing-basedapproaches)。這些方法具有較高的分辨率,主要應(yīng)用于全基因組范圍CNV
5、圖譜的構(gòu)建和疾病的關(guān)聯(lián)分析,但并不適用于診斷針對某種疾病的特定基因位點的拷貝數(shù)變異。而針對靶基因位點CNV的檢測方法有以下幾種:多重可擴(kuò)增探針雜交(Multiplexamplifiableprobehybridization,MAPH),多重連接探針擴(kuò)增(Multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA),短熒光片段多重定量PCR(QuantitativemultiplexPCRofs
6、hortfluorescentfragments,QMPSF)以及實時熒光定量PCR(Real-timequantitativePCR)。作為篩查和診斷的目的,這幾種方法都存在各自的優(yōu)缺點。以目前應(yīng)用較廣泛的MLPA方法為例,該方法高效、特異,在一次反應(yīng)中可以同時檢測40多個靶序列拷貝數(shù)的改變。不足之處在于:1、開放式檢測平臺,容易造成污染;2、其設(shè)計的長探針不能通過普通的化學(xué)方法合成,需要通過M13載體克隆的方法獲得;3、雜交步驟耗時
7、過長(約16小時)。這些都限制了其作為分子篩查方法的推廣和應(yīng)用。
實時熒光定量PCR是比較受歡迎的檢測平臺,因為操作簡便,快速高效,具有很高的敏感性和特異性;其次,是在封閉的體系中完成擴(kuò)增并進(jìn)行實時測定,有效的避免污染,而且直接檢測結(jié)果,無需擴(kuò)增后操作;另外,多熒光通道允許在同一反應(yīng)體系中同時對多個靶序列進(jìn)行擴(kuò)增。該方法已廣泛應(yīng)用于針對特定位點進(jìn)行拷貝數(shù)定量,對已知的CNV進(jìn)行確認(rèn)。但是多重PCR本身存在一些問題。如不同引
8、物對之間的錯配擴(kuò)增,不同靶序列擴(kuò)增效率不一致導(dǎo)致效率低的靶點被擴(kuò)增效率較高的靶點所抑制,這些都會影響拷貝數(shù)定量分析。
為了更好的利用實時定量PCR的優(yōu)勢,同時又避免多重PCR擴(kuò)增效率不一致的缺點,我們建立了一種基于多重加尾引物擴(kuò)增的巢式實時熒光定量PCR的新方法。我們選擇α珠蛋白基因作為建立該方法的候選基因。該方法的建立,有助于在人群中大規(guī)模篩查α珠蛋白基因的重復(fù)和缺失,建立一種可靠的分子篩查方法。在此基礎(chǔ)上,有望成為一種
9、適用于其它疾病相關(guān)的CNV進(jìn)行快速分型的通用方法。
本方法的研究原理是針對特異位點序列設(shè)計加尾引物,包括上游引物和下游引物。經(jīng)過有限循環(huán)的擴(kuò)增后,擴(kuò)增產(chǎn)物包含完整的基因組短片段序列及加尾序列。這樣就將位點的起始拷貝數(shù)等比例轉(zhuǎn)化為可供擴(kuò)增的加尾產(chǎn)物的數(shù)目。然后加入通用引物及熒光檢測探針,對不同位點的加尾產(chǎn)物同時擴(kuò)增并記錄熒光曲線Cq值。本研究將涉及到上述拷貝數(shù)變異的α1珠蛋白基因(簡稱α1)和α2珠蛋白基因(簡稱α2)作為待
10、檢基因,看家基因β-actin作為參考基因,將已知基因型的正?;蚪M樣本作為標(biāo)準(zhǔn)品,對待檢基因的拷貝數(shù)進(jìn)行相對定量。將參考基因作為內(nèi)標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo),對未知樣品待測基因位點的Cq值進(jìn)行雙重標(biāo)化,獲得基因拷貝數(shù)數(shù)值。反應(yīng)體系中總共包括三種引物及探針,分別為識別特異位點序列的加尾引物、通用引物與雙標(biāo)記的TaqMan探針。加尾引物由三個部分組成:特異位點的基因組序列、通用引物序列以及熒光標(biāo)簽序列,其中后兩者的序列與人類基因組序列無關(guān),是自行
11、設(shè)計的寡核苷酸序列組合。每個加尾序列包含各自特異的22~23bp隨機(jī)組合的熒光標(biāo)簽序列,用于結(jié)合不同熒光標(biāo)記的檢測探針,以通過不同熒光通道的擴(kuò)增曲線將不同的待檢基因區(qū)分開來。
本研究擬建立的拷貝數(shù)定量方法是建立在不同位點均一擴(kuò)增的基礎(chǔ)上,所以在進(jìn)行拷貝數(shù)計算之前,首先要評估不同位點的擴(kuò)增效率是否一致。在效率一致的前提下,才能得出的可靠拷貝數(shù)定量結(jié)果。結(jié)果顯示,在同一個反應(yīng)體系中,α1、α2及β-actin的擴(kuò)增效率分別為9
12、9.1%、98.2%及100.3%。用模板的稀釋倍數(shù)的log值對每個稀釋樣品的目標(biāo)基因與參考基因的Cq值之差△Cq(Cq目標(biāo)基因—Cq參考基因)作圖,用最小方差線性回歸法進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示兩個待檢基因α1和α2相對于參考基因β-actin的△Cq曲線斜率分別為0.019,0.029,接近于0,可認(rèn)為待檢基因與參考基因的效率一致。
為評價本方法的檢測靈敏度,我們將已知濃度(60.0ng)的正?;蛐挺力?αα樣本進(jìn)行2倍
13、倍比稀釋,用稀釋后不同濃度(3.25ng~60.0ng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),獲得Cq值后,計算不同濃度樣本α1和α2的拷貝數(shù)比值。當(dāng)濃度低至3.25ng/μL時,本的α1和α2拷貝數(shù)比值與實際的基因型相符。其他5種基因型樣本在此濃度下,得到的α1和α2拷貝數(shù)比值與基因型相符合。說明本方法的檢測靈敏度至少可以達(dá)到3.25ng/μL。
為檢驗方法的重復(fù)性,我們選取αα/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα
14、、--SEA/-α3.7、--SEA/-α4.2、-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2、-SEA/-SEA、αααanti3.7/αα、-α3.7/αααanti4.2這11種代表性基因型樣本各2例,每例樣本重復(fù)5次,對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計,考察本方法檢測的重復(fù)性。實驗結(jié)果得出的標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.00~0.16,并且不同拷貝數(shù)(0~3copies)α1/α2之間的拷貝數(shù)比值在95%可信區(qū)間范圍內(nèi)沒有重疊,單因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果具有顯
15、著差異。另外,3拷貝與2拷貝的待檢基因樣本在拷貝數(shù)上是1.5倍的差異,而在Cq值上僅相差0.585個循環(huán),這種差異對于普通的多重?zé)晒舛縋CR方法來說,是比較難區(qū)分出的。本方法顯示3拷貝基因型樣本(包括αααanti3.7/αα及-α3.7/αααanti4.2)與正常2拷貝樣本之間能有效的區(qū)分開。
最后,我們還評價了本方法的特異性。我們選取了中國人16種不同的缺失型α-地中海貧血共95例基因組樣本作為模板,進(jìn)行反應(yīng)。從結(jié)
16、果上看,我們得到待檢基因的實測拷貝數(shù)比值與樣本已知的基因型相比較,符合率為100%,并且不同基因拷貝數(shù)之間的拷貝數(shù)比值沒有重疊。
本方法的創(chuàng)新之處在于:1、將待檢基因的起始拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為可供擴(kuò)增的加尾產(chǎn)物的數(shù)量,通過一對通用引物對不同位點進(jìn)行均一擴(kuò)增,避免了直接擴(kuò)增基因組序列所造成的效率不一致問題。2、將隨機(jī)22~23bp的寡核苷酸序列作為“熒光標(biāo)簽”,與相應(yīng)熒光標(biāo)記的檢測探針結(jié)合后,在具有5’外切酶功能的聚合酶作用下,釋放
17、熒光信號。每個待檢基因加尾引物包含各自特異的“熒光標(biāo)簽”,通過不同的熒光通道擴(kuò)增曲線的Cq值來區(qū)分待檢基因。本研究中使用的“熒光標(biāo)簽”不僅用于檢測α1和α2,同樣適用于其它疾病相關(guān)的待檢基因,使本方法具備了通用的特征。3、通過有限循環(huán)的PCR預(yù)擴(kuò)增獲得完整的基因組短片段序列,達(dá)到與MLPA方法中雜交過夜后再連接相似的效果,然而我們的方法大大縮短了反應(yīng)時間,減少了反應(yīng)步驟。
本研究以α珠蛋白基因為模型,建立了一種針對疾病相關(guān)
18、靶基因拷貝數(shù)變異進(jìn)行相對定量的新方法。我們通過α1/α2的拷貝數(shù)定量,即可對中國人常見缺失型地貧進(jìn)行篩查和診斷。本方法還可檢測出三拷貝的α珠蛋白基因,這樣我們一方面可應(yīng)用該方法進(jìn)行大規(guī)模人群篩查以獲得完整的中國人群中三聯(lián)體的分布頻率數(shù)據(jù),另一方面,三聯(lián)體的檢出有助于對中間型β地貧患者提供更準(zhǔn)確的基因診斷和遺傳咨詢。在此基礎(chǔ)上,我們還可將本方法推廣到其它致病基因拷貝數(shù)變異的快速分型和診斷的應(yīng)用中。
二、快速診斷常見中國人缺失
19、型α-地中海貧血的方法學(xué)研究
α-地貧是世界上最常見的單基因遺傳病,也是我國南方各省最常見、危害最大的遺傳病。本病是由于第16號染色體短臂末端α-珠蛋白基因缺陷所致,分為缺失型和非缺失型兩種,其中缺失型是主要類型。在廣東人群中,超過96%的α-地中海貧血是由東南亞缺失(--SEA)、左側(cè)缺失(-α4.2)和右側(cè)缺失(-α3.7)引起。本病尚無有效治療方法,攜帶者篩查及產(chǎn)前基因診斷是唯一防止新的患兒出生、提高人口素質(zhì)的有效措
20、施。目前,多種分子診斷技術(shù)已用于α-地中海貧血的診斷檢測。其中多重Gap-PCR已廣泛用于α-地中海貧血的分子篩查和臨床診斷,但該方法使用凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析,一方面容易造成污染,另一方面檢測通量也受到限制。目前,實時定量PCR已廣泛應(yīng)用于臨床實驗室,該平臺是在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行反應(yīng),且無需擴(kuò)增后操作,直接檢測結(jié)果,能有效避免污染,且通量較高。因此,本研究擬建立一種基于實時熒光定量平臺的,具有穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的診斷方法,以快速診斷出中國人
21、中常見的三種缺失型α-地中海貧血。
本方法是一種基于多重探針連接反應(yīng)的巢式實時熒光定量PCR技術(shù),通過連接酶反應(yīng)獲得完整的待檢基因序列,同時通用引物序列和熒光標(biāo)簽也被加入到產(chǎn)物中,以實現(xiàn)不同待檢基因一致擴(kuò)增的效果。使我們在一個反應(yīng)管中,可以同時檢測出三種常見的缺失類型。
本研究的設(shè)計原理是針對待檢基因序列設(shè)計若干對寡核苷酸連接探針,每對連接探針分為左側(cè)探針和右側(cè)探針,分別位于待檢基因序列的相鄰部位。當(dāng)探針與基
22、因組DNA模板結(jié)合后,通過連接酶的連接反應(yīng),將左側(cè)和右側(cè)探針連接,形成一條可供擴(kuò)增的完整的連接產(chǎn)物。這樣就將待檢基因的起始拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為可供擴(kuò)增的連接產(chǎn)物的數(shù)目。所有待檢基因的左側(cè)探針和右側(cè)探針上都含有相同的通用引物結(jié)合位點,這樣我們可以通過一對引物即可同時擴(kuò)增不同的連接探針。且不同待檢基因的左側(cè)探針上有一段獨(dú)特的“熒光標(biāo)簽”,用于結(jié)合熒光檢測探針,經(jīng)實時熒光定量PCR反應(yīng)后,不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的檢測探針可以指示不同的可供擴(kuò)增的連接產(chǎn)物數(shù)量
23、,即間接指示了對應(yīng)基因的拷貝數(shù)。并且利用外切酶I切割單鏈的效應(yīng),將連接反應(yīng)中過量的連接探針?biāo)獾?,降低熒光定量的背景干擾。我們獲得代表不同待檢基因的熒光曲線Cq值,用參考基因及標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)化后,即可獲知待檢基因的拷貝數(shù)情況,判斷是否有缺失。
我們考察了多個反應(yīng)因素對連接反應(yīng)體系和實時熒光PCR檢測體系的影響,確定了各因素的最佳反應(yīng)條件。在重復(fù)性試驗中,我們以3例缺失型樣本及1例正常對照樣本為模板,每個樣本重復(fù)5次實驗,采集
24、拷貝數(shù)定量數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD值為0.04~0.12,CV為3.64~16.46%,拷貝數(shù)范圍區(qū)間沒有重疊,具有良好的可重復(fù)性和區(qū)分能力。
與MLPA方法相比,本方法最顯著的優(yōu)點之一就是連接探針完全采用化學(xué)合成的方法獲得。MLPA技術(shù)中的右側(cè)雜交探針有一段“barcode序列”,不同探針的“barcode序列”長度不同,擴(kuò)增后通過毛細(xì)管電泳來檢測PCR產(chǎn)物的長度,從而得出相關(guān)探針對應(yīng)位點的拷貝數(shù)。這使得右側(cè)雜交
25、探針長度由80bp~400bp不等,如此長的探針無法通過普通的化學(xué)方法進(jìn)行合成,只能采用M13噬菌體克隆獲得。由于雜交探針數(shù)目眾多,這就決定了這項工作的繁瑣性,不利于這項技術(shù)的應(yīng)用和推廣。本方法將原先的“barcode序列”變?yōu)椤盁晒鈽?biāo)簽”,由依靠雜交探針長度區(qū)分變?yōu)橐揽繖z測探針區(qū)分。這樣所有的單個連接探針長度都不超過70bp,完全可以采用化學(xué)合成的方法獲得,大大節(jié)省了人力和物力,保證了探針合成的數(shù)量和質(zhì)量,并且有利于這項技術(shù)的推廣應(yīng)用
26、。
在MLPA中,僅雜交過程就需要16小時,主要是因為其使用的探針長度過長,且為了減少未反應(yīng)的探針濃度,使用較低濃度的雜交探針(10pmol),這兩種因素導(dǎo)致雜交反應(yīng)時間過長。在本研究中,我們設(shè)計連接探針均為短片段,其采用相對高濃度(1.0nmol),大大超過模板DNA的濃度,30分鐘即可完成快速高效連接。大大縮短了操作時間,這對臨床診斷無疑具有重要的意義。
本研究依靠連接探針上檢測序列的不同區(qū)分不同目的基因
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