地中海貧血實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)應(yīng)用及臨床

1、地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè) 及臨床應(yīng)用,深圳益生堂生物企業(yè)有限公司,主要內(nèi)容,地中海貧血的遺傳學(xué)基礎(chǔ)地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及應(yīng)用少見型地中海貧血應(yīng)用范例技術(shù)服務(wù)簡(jiǎn)介,紅細(xì)胞,血液中數(shù)量最多的一種紅細(xì)胞運(yùn)送氧氣功能紅細(xì)胞中含 有血紅蛋白，因而使血液呈紅色 。血紅蛋白合成不足或不能合成，引起貧血。,血紅蛋白,成人血紅蛋白HbA由兩條α珠蛋白鏈和兩條β珠蛋白鏈組成，每條肽鏈有一個(gè)包含鐵原子的環(huán)狀血紅素,血紅蛋白病概念,由編

2、碼珠蛋白的基因突變引起珠蛋白肽鏈異常所致的疾病統(tǒng)稱血紅蛋白病。分為兩種情況： 1、異常血紅蛋白?。夯蛲蛔儗?dǎo)致珠蛋白肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。（珠蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變 的血紅蛋白） 2、地中海貧血：基因突變導(dǎo)致珠蛋白肽鏈合成量減少。 地中海貧血是血紅蛋白病的重要類型之一,,血紅蛋白病的分類,地中海貧血概念,地中海貧血是由于珠蛋白基因的缺 失或缺 陷使某種蛋白鏈合成受到抑制而引起的溶血性貧血，為單基因遺傳病。典型

3、的常染色體隱性遺傳病。主要有兩種類型：α-地中海貧血 β-地中海貧血,地中海貧血臨床特征（中、重度）,小細(xì)胞低色素性溶血性貧血黃疸肝脾腫大（脾大明顯）骨髓增生生長(zhǎng)發(fā)育遲緩合并感染Bart’s水腫胎輸血依賴性,地中海貧血的遺傳學(xué)基礎(chǔ),地中海貧血的遺傳規(guī)律,人體不同發(fā)育時(shí)期的血紅蛋白及其組成,人體不同發(fā)育時(shí)期的珠蛋白表達(dá)規(guī)律,蛋白鏈發(fā)育階段特異性的臨床意義,胎兒

4、血紅蛋白為α2γ2 所以α地貧的純合子(α基因不表達(dá)）,由于不能合成α肽鏈，出現(xiàn)Hb Barts水腫胎,宮內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重貧血。 （孕婦可發(fā)生妊娠高血壓綜合征、巨大胎盤、產(chǎn)后出血等并發(fā)癥）胎兒期的β鏈?zhǔn)堑退奖磉_(dá)，以γ鏈表達(dá)為主，所以β鏈的減少對(duì)胎兒期無(wú)影響，出生后頭幾個(gè)月γ鏈逐漸被β鏈取代，故重型β地貧一般在出生幾個(gè)月才出現(xiàn)貧血。（貧血逐漸加重，肝脾大，反復(fù)輸血和去鐵治療）,胎兒重型α地貧和成人HbH病的病理生理學(xué)機(jī)制,中國(guó)南方

5、α和β地貧的人群攜帶率,非缺失型α地貧,廣西地區(qū)5789例樣本中異常血紅蛋篩查結(jié)果 類型 攜帶率 α WS 1.55% α QS 0.36% α CS

6、 1.21%,α和β病理學(xué)機(jī)制和臨床分類,主要內(nèi)容,地中海貧血的遺傳學(xué)基礎(chǔ)地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及應(yīng)用少見型地中海貧血應(yīng)用范例技術(shù)服務(wù)簡(jiǎn)介,α-地貧的概念,由于α 珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變，使α鏈合成受到抑制而引起的貧血。α -基因缺陷 α -鏈不足 α -地貧 16p13 正常人共有4個(gè)α基因 (每條16號(hào)染色體上有2個(gè))正常人共有4個(gè)α基因 (每條16號(hào)染色體上有2個(gè))有4個(gè)α基因

7、(每條16號(hào)染色體上有2個(gè)),,,α地貧分子基礎(chǔ),有兩種分子機(jī)制引起α地貧：缺失型α地貧，占α地貧的95%以上，由α基因缺失引起。非缺失型α地貧，占α地貧約5%，由α基因點(diǎn)突變引起。,17種引起α珠蛋白表達(dá)降低的常見缺 失突變,中國(guó)南方人群12種非缺失型α地中海貧血的突變譜,α-地貧的分類,靜止型α地貧輕型α地貧HbH病Hb Bart’s 巴氏胎兒水腫綜合癥,靜止型α地貧,基因型：一個(gè)α-珠蛋白基因缺失或突變。

8、 表示為：-α/αα或αTα/αα (αT表示突變型）臨床表現(xiàn)：無(wú)癥狀，血常規(guī)正常 Hb電泳分析： 新生兒：Hb Bart’s 0.5%?1%。 成 人：Hb電泳難以檢出,靜止型α地貧,地貧篩查常發(fā)現(xiàn)不了，需要作基因檢測(cè)， 但若和α0地中海貧血雜合子通婚后則有 可能生育較嚴(yán)重的HbH病患兒。 常見有：-α3.

9、7/αα、-ɑ4.2/αα 、ααWS/αα,輕型α地貧,基因型：2個(gè)α-珠蛋白基因缺失 或每條染色體上各有一個(gè) 基因缺失或缺陷 表示為：- -/αα或 -α/-α 或-α/αTα臨床表現(xiàn)：無(wú)明顯癥狀；紅細(xì)胞脆性降低（<60%）； MCV<80fl；MCH<27pg；Hb正常或輕度下降

10、 亨氏小體可能陽(yáng)性 血象：小細(xì)胞低色素性貧血 Hb電泳分析： 新生兒：Hb Bart’s 1%?10% 成年人：HbA2≤ 2.5%,HbH病,基因型：3個(gè)α-珠蛋白基因缺失或突變 表示為： - -/-α（- -/αTα） 臨床表現(xiàn)： α鏈的合成受到嚴(yán)重影響，大量的β-珠蛋

11、白鏈過(guò)剩而聚合為β四聚體—HbH（β4），使紅細(xì)胞受損，導(dǎo)致慢性溶血性貧血。 有輕度或中度貧血，部分患者伴肝脾腫大及輕度黃疸，較重者亦需輸血治療。感染和服用氧化性藥物及妊娠均可使貧血加重。,HbH病,2類HbH病的血液學(xué)參數(shù)比較,α地貧疾病嚴(yán)重程度的單倍型順序,α2約占基因表達(dá)量的2/3,α1基因占1/3,Hb Bart’s 胎兒水腫綜合征,基因型：四個(gè)α-珠蛋白基因缺失或突變 表示為：-

12、 -/- - 臨床表現(xiàn)： α鏈不能合成，γ鏈聚合成 Hb Bart’s (γ4)，氧親和力高，造成組織缺氧壞死，導(dǎo)致早產(chǎn)、死胎，個(gè)別能活到足月，也會(huì)于出生幾小時(shí)內(nèi)死亡。 胎兒有蒼白、水腫、肝脾腫大，胸腹腔積液，大胎盤。孕婦容易合并妊娠高血壓綜合征及產(chǎn)后出血等并發(fā)癥。 Hb電泳分析： Hb Bart’s 70~80% Hb portland（ ζ2 γ2 ）

13、7~25% Hb A 0 Hb F 0,胎兒水腫（一）,胎兒水腫（二）,中國(guó)人常見的缺失型α地貧,α0地貧：一條染色體上缺失兩個(gè)連鎖的α基因，即α1和α2 基因都缺失，如- -SEA/ ，又稱東南亞缺失型; - -THAI / , 又稱泰國(guó)型缺失。 α+地貧：是一條染色體上缺失1個(gè)α基因（α1或α2），分兩種： -α3.7（右側(cè)缺失）：缺失α2的3`端和α1的5`端，缺失片段約

14、 3.7kb。 -α4.2 （左側(cè)缺失）：α2 基因完全缺失，α1 基因完整，缺失 片段為4.2kb。 由于α2基因的表達(dá)水平占整個(gè)α基因表達(dá)量的70%左右，理論上左缺失型比右缺失型對(duì)α基因表達(dá)的影響大。,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷技術(shù),篩查+基因檢測(cè)：1、血細(xì)胞自動(dòng)分析技術(shù)：

15、獲取數(shù)據(jù)：RBC、HGB，MCV MCH等數(shù)據(jù)。2、血紅蛋白分析：獲取數(shù)據(jù)：HbA、HbA2、HbF以及一些異常血紅蛋白3、Gap-PCR：獲取數(shù)據(jù)：缺失型α、缺失型β4、反向點(diǎn)雜交（RDB)）：非缺失型α、β,α 缺失型地貧的診斷（Gap-PCR法） 益生堂,檢測(cè)中國(guó)人群常見4 種α-地中海貧血缺失型：

16、--SEA ，-α3.7，-a4.2 和- -THAI ； 國(guó)內(nèi)唯一獲得CFDA批準(zhǔn)檢測(cè)泰國(guó)型缺失的試劑，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，減少漏診風(fēng)險(xiǎn);。 可用于抗凝外周血樣本、羊水樣本或胎絨毛樣本等。靈敏度高。 單管多重PCR，檢測(cè)流程簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。,Gap-PCR檢測(cè)缺失型α地中海貧血基因,非缺失型α的診斷（PCR探針法）益生堂,檢測(cè)中國(guó)人群中常見的3種α2 基因點(diǎn)突變: α CS 、α QS、α WS檢測(cè)非缺失型α和

17、β地貧基因時(shí)各項(xiàng)控制參數(shù)相同，可同機(jī)擴(kuò)增、同管雜交、洗滌、顯色雜交時(shí)間靈活（可雜交2-18小時(shí)），便于合理安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間,非缺失型α地貧基因檢測(cè) （RDB法）,3種非缺失型α地貧突變位點(diǎn) (α WS α,CAC?CAG; α QSα,CTG?CCG; α CS α,TAA?CAA),α地貧的遺傳咨詢（一）,α地貧的遺傳咨詢（二）,α地貧的遺傳咨詢（三）,α地貧產(chǎn)前診斷指征（一）,夫婦雙方都攜帶--SEA /αα 夫

18、婦雙方都攜帶--THAI /αα 夫婦一方為--SEA /αα 另一方為--THAI /αα 有1/4的機(jī)會(huì)生育Hb Bart?s 水腫胎，需要產(chǎn)前診斷。,α地貧產(chǎn)前診斷指征（二）,一方為--SEA /αα 或--THAI /αα ,其配偶為αTα非缺失型α突變（突變型為CS、QS）,需要產(chǎn)前診斷。,α地貧診斷小結(jié),首先夫婦雙方做地貧篩查（血常規(guī)+Hb分析）篩查提示α -地貧時(shí)，雙方做α -基因檢查（注意同時(shí)檢查

19、缺失及非缺失α 基因）若基因結(jié)果出現(xiàn)α -地貧產(chǎn)前診斷指征，需要做產(chǎn)前診斷根據(jù)具體情況選擇產(chǎn)前診斷方法胎兒為HbBarts水腫胎時(shí)，建議終止妊娠；為HbH病時(shí)，根據(jù)病人意愿處理,β地貧分子基礎(chǔ),大部分β基因點(diǎn)突變和少部β基因缺失,β地貧的概念,由于β珠蛋白基因的突變，引起血紅蛋白β鏈合成的減少或缺乏而形成的溶血性貧血。β-基因缺陷 β鏈不足 β地貧β基因在11號(hào)染色體上（11p15），每條染色體

20、上有1個(gè)基因。,,,β珠蛋白基因突變及其對(duì)基因功能的影響,β0 : β珠蛋白鏈不能合成 β+ : β珠蛋白鏈合成減少,中國(guó)南方人群46種β地貧點(diǎn)突變譜及其功能影響,β珠蛋白基因突變及其對(duì)基因功能的影響,β地貧常見的基因缺失突變,β地貧病臨床表現(xiàn)及分型,β地貧病臨床表現(xiàn)及分型,注：根據(jù)人體不同發(fā)育時(shí)期的血紅蛋白及其組成，胎兒發(fā)育直至出生時(shí)β基因低水平表達(dá)，導(dǎo)致β地中海貧血的突變對(duì)基因的抑制作用在出生時(shí)難以顯示，因此重型β

21、地貧患兒出生時(shí)不會(huì)表現(xiàn)出疾病類型。出生后幾個(gè)月發(fā)?。?周歲內(nèi)） 基因確診！,β地貧基因型與表型的關(guān)系,夫婦雙方均為β地貧攜帶者（β0或β+），有1/4的機(jī)會(huì)生育中、重型β患兒。,β地貧的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),1、篩查：篩查指標(biāo)（與前述α -地貧一樣）：血常規(guī)+Hb分析儀器：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Hb電泳儀或高效液相分析儀篩

22、查陽(yáng)性： MCV〈80 fL，MCH 3.5%HbA2升高對(duì)判斷β-地貧至關(guān)重要，幾乎可篩查出所有β-地貧基因攜帶者。,β地貧的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),2、β地貧的基因檢測(cè) PCR- RDB法注意：大部分所用基因檢測(cè)方法只檢測(cè)常見的17個(gè)β基因點(diǎn)突變，不能檢查少見或罕見的點(diǎn)突變。當(dāng)檢測(cè)陰性時(shí)，應(yīng)結(jié)合HbA2值判斷。,β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（PCR探針法） （益生堂）,起始樣本為抗凝人全血，羊水或胎絨毛

23、。檢測(cè)高通量，一份標(biāo)本只需做一管PCR即可鑒別臨床意義重大的17種β點(diǎn)突變。全過(guò)程大約6-8小時(shí)。寡核苷酸探針雜交，特異性高，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好易于推廣應(yīng)用，凡能開展PCR實(shí)驗(yàn)的單位(有PCR儀和分子雜交爐/恒溫水浴搖床)均能采用本試劑盒。與非缺失α-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增條件相同。采用相 同的擴(kuò)增和雜交參數(shù)，一臺(tái)PCR 儀同時(shí)擴(kuò)增，同管雜交，且同一 份雜交物可經(jīng)過(guò)1-2次的重新雜交，可進(jìn)行結(jié)果的復(fù)核與驗(yàn)證。

24、,檢測(cè)原理(PCR-RDB用于檢測(cè)α和β點(diǎn)突變),重型β地貧：β0突變雙重雜合子,β地貧復(fù)合α地貧,指同時(shí)攜帶有β地貧和α地貧，因?yàn)槭遣煌愋偷牡刎?，患者一般無(wú)癥狀。地貧篩查的表現(xiàn)同β地貧（MCV↓, Hb A2↑），因此無(wú)法與單純的β地貧區(qū)別開。檢查β地貧攜帶者的α地貧基因是唯一的區(qū)別方法。,β地貧復(fù)合α地貧,因此，當(dāng)夫婦雙方的一方是α地貧，另一方是β地貧時(shí)，β地貧攜帶者應(yīng)檢查α地貧基因。若是β地貧復(fù)合α 地貧，則

25、根據(jù)情況產(chǎn)前診斷。,β地貧復(fù)合α地貧示例,β地貧復(fù)合α地貧示例,,,基因診斷方法,Gap-PCR技術(shù)，缺失型α-地中海貧血基因檢測(cè)的首選方法PCR-探針法(RDB)技術(shù)，β-地中海貧血突變基因檢測(cè)、非缺失型α-地中海貧血突變基因檢測(cè)的首選方法MLPA (缺失型α、β分子診斷技術(shù)）DHPLC（β地中海貧血突變分析 ）DNA序列測(cè)定法（direct sequencing,DS）基因突變檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)（HR

26、M或HRMA）:DNA序列突變的檢測(cè),主要內(nèi)容,地中海貧血的遺傳學(xué)基礎(chǔ)地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及應(yīng)用少見型地中海貧血應(yīng)用范例技術(shù)服務(wù)簡(jiǎn)介,少見型地貧基因檢測(cè)指征及流程,示例 一：β地貧的基因診斷（基因測(cè)序）,試劑盒檢測(cè)范圍只包括17個(gè)β基因點(diǎn)突變，不能檢測(cè)少見或罕見的點(diǎn)突變，當(dāng)檢測(cè)到陰性時(shí)，應(yīng)結(jié)合HbA2值綜合判斷。,β地貧的基因診斷 (基因測(cè)序）,7195測(cè)序結(jié)果： 在nt397處出現(xiàn)雙峰，G＞A，對(duì)應(yīng)于CD37(

27、TGG＞TAG)，已知文獻(xiàn)報(bào)道與β-地貧有關(guān)。,示例一中β地貧的基因診斷 (基因測(cè)序）,,示例二：β地貧的基因診斷（基因測(cè)序）,2015年11月深圳市 醫(yī)院， 1 孕婦遺傳咨詢父親 41-42M雜合子 母親 未檢出17種β突變先證者 （？歲）夫妻倆第一個(gè)孩子 檢出 41-42M雜合子 但每月需定期輸血！母親可能 存在試劑盒檢測(cè)范圍外的突變，先證者、母親均進(jìn)行β測(cè)序母親：CD8-9(+G)突變，已知文獻(xiàn)報(bào)道

28、與β-地貧有關(guān)先證者： CD8-9(+G)和CD41-42（ -TCTT ）突變胎兒：未檢出β突變（測(cè)序結(jié)果有效范圍：β珠蛋白基因-90至IVS-2-100、IVS-2-500至3，Poly A部分，包含了«地中海貧血預(yù)防控制操作指南»中報(bào)道的46種中國(guó)南方人群β-地中海貧血突變位點(diǎn)及在此區(qū)域內(nèi)的未知突變位點(diǎn)。）,示例二中先證者測(cè)序圖,示例二中先證者測(cè)序圖,示例三：β地貧基因檢測(cè)（缺失型β ）,父親： --SEA

29、 /αα 27-28M/27-28M母親： --SEA /αα βN/ βN 胎兒(臍血）： αα /αα βN/ βN 小孩未遺傳到父親的27-28M位點(diǎn)突變，不符合遺傳規(guī)律父親是否有缺失β（無(wú)篩查指標(biāo)）,示例三：β地貧基因檢測(cè)（缺失型β ）,示例四：少見α缺失,女，39歲，福建永泰人，漢族，2015年4月進(jìn)行孕期檢查。查體：貧血面容。HGB 96 g／L、

30、(MCV)52.4 fl、(MCH)15.2 Pg、Hb A2 1.5％，常規(guī)地貧基因檢測(cè)檢出東南亞型α地貧缺失片段(--SEA/--SEA)，提示懷疑存在其他缺失片段。 確認(rèn)基因型：-α27.6/--SEA,問(wèn)題一：MCV低一定是地貧嗎,問(wèn)題二：血紅蛋白異常一定是地貧嗎,問(wèn)題三,問(wèn)題四,問(wèn)題五：什么情況下需要作地貧的產(chǎn)前診斷,雙方為同一種地貧攜帶者懷孕或分娩過(guò)巴氏水腫胎分娩過(guò)重度β地貧患兒夫婦雙方之一為α地貧基因攜帶

31、者，另一方為β合并α地貧基因攜帶者,主要內(nèi)容,地中海貧血的遺傳學(xué)基礎(chǔ)地中海貧血的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及應(yīng)用少見型地中海貧血應(yīng)用范例技術(shù)服務(wù)簡(jiǎn)介,少見型地中海貧血基因檢測(cè)服務(wù)（一）益生堂,α缺失型地貧： -α2.4 、-α27.6 、 -α21.9 、HKαα等,香港型缺失HKαα檢測(cè)示例,少見型地中海貧血基因檢測(cè)服務(wù)（二）益生堂,α點(diǎn)突變（測(cè)序法）α1: CD74 (GAC>CAC)、CD78 (-

32、C) CD118（+TCA) α2: CD13 （GCC>TCC)、CD30(-GAG) 、 CD31 (AGG>AAG)、 CD43/44(-C) 、 CD49(-GC)、 CD59(GGC>GAC),少見型地中海貧血基因檢測(cè)服務(wù)（三）益生堂,少見型地中海貧血基因檢測(cè)服務(wù)（四）益生堂,缺失β地貧中國(guó)型（chinese）東南亞型（S.E.As