老年人MBL基因ExonⅠ點(diǎn)突變頻率及其血漿含量變化研究.pdf

1、目的：甘露(聚)糖結(jié)合凝集素(mannose-bindinglectin，MBL)是一種主要由肝臟合成的急性時(shí)相蛋白，屬于凝集素家族，在天然免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MBL水平與多種疾病有關(guān)，MBL缺失或含量低下可增加感染性疾病的易感性和感染的嚴(yán)重程度。目前發(fā)現(xiàn)MBL基因ExonⅠ52、54和57位密碼子堿基突變是血中MBL缺乏或低下的主要原因。老年人免疫功能會(huì)有不同程度的減退，衰老對MBL的影響，國內(nèi)研究較少。本研究的主要目的是調(diào)

2、查健康老年人MBL基因ExonⅠ52、54和57化密碼子點(diǎn)突變的頻率和血漿MBL含量變化，為進(jìn)一步探討老年人天然免疫功能狀態(tài)，從抗感染免疫的角度為MBL在老年人的感染預(yù)防和治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法： 1標(biāo)本的收集與處理：收集漢族79例健康老年人、64例中青年人(作為對照)健康體檢全血標(biāo)本(EDTA-Na2)，分離血漿與細(xì)胞成分，血漿用于MBL含量測定，細(xì)胞成分用于提取DNA；取細(xì)胞成分，低滲溶血法溶解紅細(xì)胞，提取白細(xì)

3、胞，用鹽酸胍法捉取DNA，采用紫外吸收法進(jìn)行DNA純度及含量的測定。 2MBL基因ExonⅠ52、54和57位密碼子點(diǎn)突變檢測方法的建立：(1)52位密碼子點(diǎn)突變檢測方法即PCR-SSP的建立：①參照文獻(xiàn)由大連寶生物工程有限公司合成兩對序列特異性引物：52位密碼子突變型引物(primerl和primer2)和野生型引物(primerl和primer3)。引物序列為：primerl(上游)：5’-CACCCAGATTGTAGGAC

4、AGAG-3’；primer2(下游)：5’-TCTCCCTTGGTGCCATCAC(A)-3’；primer3(下游)5’-TCTCCCTTGGTGCCATCACG-3’。②優(yōu)化選擇PCR反應(yīng)的最佳條件：將Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶濃度設(shè)置為不同的濃度梯度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。③特異性試驗(yàn)：采用從HBV和結(jié)核桿菌提取的DNA作為對照，進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定是否出現(xiàn)預(yù)期大小的DNA片斷，選擇不同類型的標(biāo)本測序，進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性。④重

5、復(fù)性試驗(yàn)：同一標(biāo)本在相同條件下，5天內(nèi)連續(xù)測定5次。(2)MBL基因54、57位密碼子點(diǎn)突變檢測方法即PCR-RFLP的建立：①引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)MBL基因ExonⅠ的序列設(shè)計(jì)一對引物，引物序列為primer1(上游)：5-AGGGCATGCTCGGTAAAT-3；primer2(下游)：5-CTCATATCCCCAGGCAGTT-3。②優(yōu)化選擇PCR反應(yīng)的最佳條件：Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶濃度優(yōu)化試驗(yàn)同PCR-SS

6、P的建立；退火溫度設(shè)置為53℃、55℃、58℃和60℃四個(gè)溫度進(jìn)行優(yōu)化選擇。③特異性和重復(fù)性試驗(yàn)同PCR-SSP建立。④BanⅠ和MboⅡ酶切擴(kuò)增產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物純化，純化的PCR產(chǎn)物用BanⅠ和MboⅡ酶切，分別用于54、57位密碼子點(diǎn)突變檢測。⑤根據(jù)酶切結(jié)果，選擇不同類型的標(biāo)本測序，進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性。 3收集的標(biāo)本用建立的PCR-SSP、PCR-RFLP方法檢測52、54、57位密碼子點(diǎn)突變。4收集的標(biāo)本用ELISA法

7、測定MBL含量。 結(jié)果： 1PCR-SSP測定MBL基因ExonⅠ52位密碼予點(diǎn)突變方法的建立：①通過PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化選擇，確定Mg2+濃度為1.6mmol/L、dNTPs濃度為0.8mmol/L、TaqDNA聚合酶濃度為0.08U/μl(均為反應(yīng)終濃度)。②乙肝病毒和結(jié)核桿菌提取的DNA擴(kuò)增未出現(xiàn)擴(kuò)增帶，人類基因組DNA出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增帶。擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)兩種情況：含有野生型引物的擴(kuò)增體系有擴(kuò)增帶，含有突變型引物的擴(kuò)增體系

8、無擴(kuò)增帶；含有野生型引物和突變型引物的擴(kuò)增體系均有擴(kuò)增帶。兩種情況分別代表52位密碼子為野生型和雜合突變型，電泳結(jié)果與測序結(jié)果一致。③5次重復(fù)測定結(jié)果一致。 2PCR-RFLP測定MBL基因ExonⅠ54、57位密碼子點(diǎn)突變方法的建立：①通過PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化選擇，確定Mg2+濃度為1.5mmol/L、dNTPs濃度為0.8mmol/L、TaqDNA聚合酶濃度為0.04U/μl(均為反應(yīng)終濃度)、退火溫度55℃。②乙肝病毒和結(jié)

9、核桿菌提取的DNA擴(kuò)增末出現(xiàn)擴(kuò)增帶，人類基因組DNA出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增帶。③5次重復(fù)測定結(jié)果一致。④擴(kuò)增產(chǎn)物用BanⅠ酶切后電泳出現(xiàn)三種情況：顯示兩條帶，對應(yīng)的DNA片斷大小為236bp和94bp；顯示三條帶，對應(yīng)的DNA片斷大小為330bp、236bp和94bp；顯示一條帶，DNA片斷大小為330bp，三種情況分別代表54位密碼子為野生型、雜合突變型和純合突變型。⑤擴(kuò)增產(chǎn)物用MboⅡ酶切后結(jié)果出現(xiàn)一種情況，即顯示一條帶，DNA片斷大小為33

10、0bp，代表57位密碼予為野生型。不同類型標(biāo)本酶切后電泳結(jié)果與測序結(jié)果一致。 352位密碼子基因突變(TGT)頻率：老年組和中青年組分別為0.6％和0.8％，確切概率P=0.801。 454位密碼子基因突變(GAC)頻率：老年組和中青年組分別為20.9％和16.4％。 557位密碼子基因突變(GAA)頻率：老年組和中青年組均為0％。 6血漿MBL含量測定結(jié)果：老年組(79例)和中青年組(64例)MBL含量

11、分別為2,017±1，804μg/L,和2,523±1，955μg/L，t=1.641，P=0.109；老年組(49例)和中青年組(43例)(野生型)MBL含量分別為2,956±1，701μg/L和3,432±1，687μg/L,t=1.36,P=0.1775；老年組(30例)和中青年組(21例)(突變型)MBL含量分別為530±360μg/L和709±916μg/L,t=0.95,P=0.3448。 結(jié)論： 1本研究中

12、建立的PCR-SSP和PCR-RFLP檢測MBL基因ExonⅠ52、54和57化密碼子點(diǎn)突變的方法，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。 252位密碼子基因點(diǎn)突變頻率：健康老年組與中青年組分別為0.6％和0.8％，二者點(diǎn)突變頻率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，確切概率P=0.801，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 354位密碼子基因突變(GAC)頻率：健康老年組和中青年組分別為20.9％和16.4％，健康老年組比中青年組偏高，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.