阿爾茨海默病重組Aβ1-15表位嵌合疫苗研究.pdf

1、阿爾茨海默病是老年癡呆的一種，作為一種神經(jīng)退行性疾病，它不僅使患者的學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力急劇減弱，同時(shí)也給罹患此病的病人及家庭帶來的極大的痛苦和困擾。阿爾茨海默病的發(fā)病率正以驚人的速度不斷增長，全球患病者人數(shù)日益增多，使得全球各個(gè)國家不得不重視該病發(fā)生發(fā)展所帶來的危害和影響，因此針對該病進(jìn)行有效的預(yù)防和治療已成為當(dāng)下科學(xué)研究者刻不容緩的責(zé)任。
　　依據(jù)目前認(rèn)可度較高的淀粉樣假說理論，APP蛋白的異常降解導(dǎo)致患者大腦中積累大量可溶性Aβ4

2、2或Aβ40肽，進(jìn)一步的聚集導(dǎo)致了大腦內(nèi)淀粉樣斑塊的形成。同時(shí)毒性Aβ42肽的存在促進(jìn)Tau蛋白的磷酸化以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的壞死等，導(dǎo)致一系列的病理蛋白積累及病理反應(yīng)，最終促成了阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展。因此靶向Aβ肽的治療方法——主動免疫和被動免疫，成為當(dāng)下免疫治療阿爾茨海默病的主流方案。
　　通過對AN-1792臨床試驗(yàn)失敗的結(jié)果進(jìn)行探究分析知，Aβ1-42肽的T細(xì)胞表位引發(fā)了自身毒性T免疫細(xì)胞反應(yīng)，因此選取適當(dāng)?shù)募?xì)胞表位構(gòu)建新型

3、疫苗用以進(jìn)行阿爾茨海默病的防治，且能夠特異性清除最具毒性的Aβ寡聚體，是新的免疫治療策略。
　　正是基于這種設(shè)計(jì)理念，先前本課題組選取了Aβ1-42的B淋巴細(xì)胞表位Aβ1-15進(jìn)行疫苗抗原的構(gòu)建工作。采用Aβ1-15多拷貝串聯(lián)連接輔助性T細(xì)胞表位載體分子的方式構(gòu)建了一系列的嵌合抗原。隨后完成嵌合抗原的原核表達(dá)純化，并對所構(gòu)建嵌合抗原完成了初步的免疫原性探討，證實(shí)嵌合抗原疫苗在普通Balb/c和APP小鼠身上具有良好的免疫原性，誘導(dǎo)

4、產(chǎn)生了具有Aβ42寡聚體特異結(jié)合的治療性抗體，且能清除腦內(nèi)的Aβ沉積，具有良好的疫苗效果。
　　本研究選取了兩種最具代表性且初期實(shí)驗(yàn)效果較優(yōu)的兩種表位嵌合抗原——6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C，進(jìn)行深層次的免疫原性和疫苗效應(yīng)評價(jià)。首先對原核表達(dá)純化的嵌合抗原進(jìn)行了免疫原性的研究。通過6Aβ15-T與不同佐劑聯(lián)合免疫普通Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠，測定免疫后小鼠的抗體水平以及細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選獲得最優(yōu)抗原佐劑配

5、對方案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，嵌合抗原聯(lián)合A1佐劑免疫實(shí)驗(yàn)小鼠后，小鼠體內(nèi)能產(chǎn)生較強(qiáng)的針對Aβ42的特異性抗體，免疫反應(yīng)偏向于Th2型，細(xì)胞免疫結(jié)果顯示主要產(chǎn)生針對輔助性T細(xì)胞表位特異性的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，無Aβ42特異性的T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。且以上免疫反應(yīng)相較于其他佐劑聯(lián)合免疫組，產(chǎn)生更明顯的Th2型抗體反應(yīng)，提示傳統(tǒng)的人用A1佐劑作為AD疫苗的佐劑是合適并有效的。而后利用A1佐劑同時(shí)聯(lián)合兩種表位嵌合抗原在3×Tg AD模型小鼠身上進(jìn)行抗原

6、的免疫原性研究。結(jié)果顯示免疫后的AD模型小鼠體內(nèi)也產(chǎn)生了較高水平的針對Aβ42肽的抗體，且免疫反應(yīng)偏向于Th2型。淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，AD模型小鼠沒有產(chǎn)生針對Aβ42肽的自身毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。AD模型小鼠免疫實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，嵌合抗原能夠克服免疫耐受，免疫后誘使機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的Th2型免疫反應(yīng)，提示該疫苗具有較好的應(yīng)用前景。
　　最后，重組嵌合抗原6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C聯(lián)合A1佐劑在3×Tg AD模型小鼠身上

7、進(jìn)行免疫預(yù)防和免疫治療實(shí)驗(yàn)研究，以此評價(jià)疫苗效應(yīng)。這兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分別在3M小鼠和12M小鼠身上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3M和12M小鼠的免疫治療過程中，兩種嵌合抗原的注射均能誘使機(jī)體產(chǎn)生高水平的抗體，且能在體內(nèi)維持較長時(shí)間。免疫反應(yīng)偏向于Th2型，無Aβ42特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。對水迷宮數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，兩種嵌合抗原免疫組小鼠的行為認(rèn)知和記憶學(xué)習(xí)能力較未治療小鼠有較明顯的提升。同時(shí)對小鼠腦組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，治療后可溶性Aβ寡聚體減少，由毒

8、性Aβ誘發(fā)的一些病理指示性蛋白也發(fā)生了某些良性變化。DynaminⅠ隨著病程發(fā)生，表達(dá)量會降低，而治療后小鼠與對照相比，蛋白表達(dá)量明顯增高。而受毒性Aβ影響而發(fā)生降解的Spectrin蛋白，在治療小鼠中能看到降解減緩的趨勢。提示AD病理特征的減弱，病情好轉(zhuǎn)，與典型病理指標(biāo)和行為學(xué)能力表現(xiàn)相一致。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為直觀地顯示出治療后小鼠Aβ斑塊沉積明顯減少，磷酸化Tau蛋白也有緩解的趨勢。盡管免疫治療的12M小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平較3M

9、小鼠產(chǎn)生的抗體弱，但是也能達(dá)到較高的抗體水平，能夠產(chǎn)生有效的免疫治療效果。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種重組表位嵌合抗原6Aβ15-T和6Aβ15-THc-C在普通小鼠和AD模型小鼠身上均具有良好的免疫反應(yīng)，能夠產(chǎn)生Aβ42寡聚體特異結(jié)合的Th2型治療性抗體。且利用這兩種抗原免疫治療AD小鼠后，AD小鼠的病理特征明顯減弱，學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知能力得到較好的提升，提示這兩種嵌合抗原疫苗具有良好的免疫治療效果，可作為在免疫治療阿爾茨海默病的候選