破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位疫苗研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)作為一種中樞退行性疾病，是老年癡呆的最主要形式。依據(jù)最新的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，世界上大約有2700萬人口受到該病的影響。目前，淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(Amyloid Cascade Hypothesis)是一種主流的關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制的推測(cè)。該假說認(rèn)為患者腦內(nèi)堆積過多的β淀粉樣多肽是造成AD的最根本原因。1999年，Schenk等首先開展了以Aβ為靶點(diǎn)的AD主動(dòng)免疫治療研究，將人纖維化的Aβ1

2、—42(簡稱Aβ42)多肽聯(lián)合弗氏佐劑免疫APP轉(zhuǎn)基因小鼠Tg2576后，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)Aβ42的抗體，減少了大腦內(nèi)的淀粉樣斑塊，改善了認(rèn)知能力。隨后，動(dòng)物模型上的其他相關(guān)研究表明AD的主動(dòng)免疫治療策略是有效的，但之后的AN—1792臨床試驗(yàn)結(jié)果表明Aβ42中存在的2個(gè)T細(xì)胞表位(17—21，29—42)誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞免疫反應(yīng)使得受試者出現(xiàn)了急性腦膜炎癥狀。目前關(guān)于AD主動(dòng)免疫的研究更傾向于使用Aβ42的B細(xì)胞表位(1—15)并去

3、除有害的T細(xì)胞表位，既讓疫苗達(dá)到促進(jìn)抗體生成的目的，又從根本上避免之前臨床試驗(yàn)所產(chǎn)生的不良反應(yīng)。因此，我們?cè)诖死碚摶A(chǔ)上進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位重組亞單位疫苗和核酸疫苗的研究工作。
　　 首先進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位重組亞單位疫苗的研究，設(shè)計(jì)了3種融合多個(gè)Aβ1—15(簡稱Aβ15)串聯(lián)基因、PADRE基因和破傷風(fēng)毒素重鏈C端(簡稱TTC)基因的重組蛋白原核表達(dá)

4、載體，實(shí)現(xiàn)了重組融合蛋白在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并成功地純化得到了電泳級(jí)純度的重組蛋白。然后將純化獲得的重組蛋白免疫普通Balb/C小鼠，測(cè)定的抗Aβ特異性抗體水平結(jié)果顯示重組蛋白免疫動(dòng)物后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的Aβ特異性抗體，并且通過血清抗體的亞型分析和脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明產(chǎn)生的抗Aβ抗體傾向于與Aβ寡聚體結(jié)合，與纖維狀A(yù)β結(jié)合能力較弱。進(jìn)一步將其中一種重組蛋白免疫APP轉(zhuǎn)基因AD模型

5、小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白在模型小鼠中仍然具有良好的免疫原性，免疫特性與普通Balb/C小鼠相似。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示免疫后小鼠認(rèn)知能力得到了一定改善。小鼠大腦組織免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明免疫組小鼠Aβ斑塊明顯減少。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示重組蛋白作為預(yù)防或治療AD的候選亞單位疫苗具有良好的應(yīng)用前景。
　　 在重組蛋白亞單位疫苗研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了破傷風(fēng)毒素片段作載體分子介導(dǎo)的阿爾茨海默病B細(xì)胞表位核酸疫苗的研究。設(shè)計(jì)了2種融合6個(gè)Aβ1

6、—15串聯(lián)基因、PADRE基因和破傷風(fēng)毒素重鏈C端基因的DNA真核表達(dá)載體作為DNA疫苗。經(jīng)IFA檢測(cè)表明得到的2種真核表達(dá)載體均能使Aβ15和TTC基因在真核細(xì)胞中得到有效地表達(dá)。DNA疫苗免疫普通小鼠誘導(dǎo)生成了較高水平的抗Aβ抗體，并且免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然提示設(shè)計(jì)的DNA疫苗產(chǎn)生的抗體傾向與Aβ可溶性寡聚體結(jié)合。DNA疫苗免疫APP轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠后，也產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng)，并且免疫組小鼠大腦組織內(nèi)的A

7、β斑塊明顯少于未免疫組小鼠，提示該DNA疫苗可能擁有較好的免疫預(yù)防效果，可作為AD疫苗的一種新發(fā)展方向。
　　 綜上，本研究設(shè)計(jì)和制備了3種重組蛋白亞單位疫苗和2種重組核酸疫苗，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各疫苗在普通Balb/C小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了高水平的針對(duì)Aβ42的特異性抗體，并且有效地避免了Th1型免疫反應(yīng)，免疫反應(yīng)完全偏向于Th2型。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)生的抗體傾向于與Aβ寡聚體結(jié)合，提示抗體可能針對(duì)毒性較大的Aβ寡聚體擁有更好的清除或中和能