引起對蝦早期死亡綜合征的副溶血性弧菌的分離鑒定及發(fā)病機(jī)理研究.pdf

1、自2009年開始，亞洲蝦類養(yǎng)殖開始爆發(fā)一種未知的新興疾病，養(yǎng)殖的對蝦在養(yǎng)殖初期（35天左右）就以極快的速度死亡，因此得名早期死亡綜合征（EMS），由于其可以使患病對蝦的肝胰腺出現(xiàn)急性壞死的癥狀，被更形象的命名為急性肝胰腺壞死綜合征（AHPNS）。該疾病在之后幾年內(nèi)迅速蔓延至越南、馬來西亞、泰國和墨西哥。2013年初，研究人員基本確認(rèn)了一種特殊的副溶血性弧菌為該病的主要病因，這種特別的副溶血性弧菌中含有的獨(dú)特的質(zhì)粒，可以編碼出的類殺蟲毒素

2、的毒素蛋白，會引起蝦類的肝胰腺壞死。本論文從中國廣東西南沿海爆發(fā)過EMS的養(yǎng)殖池塘中對病原菌進(jìn)行了分離和深入地鑒定。通過構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室南美白對蝦動物模型，對獲得的EMS病原菌進(jìn)行了攻毒驗(yàn)證，對其毒力基因表達(dá)和毒力表型的規(guī)律進(jìn)行了探索研究。主要結(jié)果如下：
　　1.對蝦早期死亡綜合征病原菌的分離
　　以副溶血弧菌食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)GB/T4789.7-2013和美國FDA細(xì)菌分析手冊為參照標(biāo)準(zhǔn)，在疾病爆發(fā)區(qū)域的對蝦養(yǎng)殖場中，采集健

3、康、瀕死、死亡對蝦、池塘水樣、泥土樣，以副溶血性弧菌為主要分離對象，進(jìn)行細(xì)菌分離工作。在8個不同位置的養(yǎng)殖池塘中共分離出81株常見的海洋細(xì)菌，其中39株為副溶血性弧菌。使用三對較權(quán)威的引物對81株細(xì)菌進(jìn)行鑒定，選取三對引物均為陽性的菌株作為對蝦早起死亡綜合征的疑似病原菌株。總共篩選出12株疑似病原菌。
　　2.對蝦早期死亡綜合征病原菌的鑒定
　　對篩選出的12株疑似病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。常規(guī)毒力基因鑒定結(jié)果顯示這些菌株均

4、含有tlh基因，不含有tdh和trh基因，因此不會對人類健康產(chǎn)生太大的威脅。通過API20E微生物鑒定條對菌株進(jìn)行了菌種鑒定，并通過對16S rRNA基因測序做了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示這些菌株全部為副溶血性弧菌。通過ERIC-PCR和質(zhì)粒指紋圖譜對菌株的多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明這12株菌的多樣性較為單一。對毒素基因pirA的全長進(jìn)行了擴(kuò)增和測序，發(fā)現(xiàn)此12株菌均含有該毒素基因并具有很高的同源性。提取了這些菌株的總RNA并測定了毒力基因

5、pirA的表達(dá)量，結(jié)果顯示毒力基因的表達(dá)情況在菌株之間存在較大差異，表達(dá)量最高和最低相差約13倍。使用SDS-PAGE和Western Blotting的方法對蛋白表型和毒素蛋白進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明與已經(jīng)確證的病原菌株3HP相比，本研究分離獲得的12株菌株菌有特異性的毒素蛋白分泌。
　　由此分別從菌株的菌種信息、多樣性分析、質(zhì)粒指紋圖譜、毒素基因的多樣性、轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的層面對疑似病原菌株進(jìn)行了深入地鑒定。
　　3.南美白對

6、蝦動物模型的建立及攻毒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
　　本研究構(gòu)建了可用于實(shí)驗(yàn)室攻毒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的小型南美白對蝦動物模型。對蝦養(yǎng)殖、攻毒設(shè)備可控溫度范圍為室溫至34℃，監(jiān)控的水質(zhì)指標(biāo)主要為 pH（6.7-8.5）、亞硝酸鹽＜0.1 mM、總氨氮含量＜0.35 mM，每組實(shí)驗(yàn)最大水體體積為50 L。
　　首先使用了3HP菌株對攻毒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的感染方式和感染濃度進(jìn)行了確定，最終選擇以小體積菌液浸泡的方式感染對蝦，感染用菌液濃度為106CFU/mL，感染時

7、間15 min。攻毒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)以無毒的S02和無菌的TSB+培養(yǎng)基為陰性對照，分別驗(yàn)證副溶血性弧菌和培養(yǎng)基對于實(shí)驗(yàn)的影響。感染后每12 h觀察記錄一次，并收取死亡對蝦尸體，進(jìn)行組織病理學(xué)切片觀察確癥。結(jié)果表明，12株菌株均具有使對蝦患早期死亡綜合征的毒力，除F5和F18號菌株，其余10株均可達(dá)到100％致死率，其中多數(shù)菌株可以在48 h以內(nèi)使感染對蝦迅速大量死亡。通過組織切片鑒定也可發(fā)現(xiàn)這些對蝦的肝胰腺組織呈現(xiàn)壞死癥狀，具有典型的對蝦早期

8、死亡綜合征的病癥特點(diǎn)。以無毒的S02菌株作為陰性對照的實(shí)驗(yàn)組只有1只對蝦死亡，（TSB+培養(yǎng)基對照組無對蝦死亡），組織切片結(jié)果顯示并未出現(xiàn)肝胰腺壞死的癥狀。這些結(jié)果都與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果相吻合。通過上述實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)，此12株副溶血性弧菌為對蝦早起死亡綜合征的致病菌株。
　　4.毒素基因表達(dá)和毒力對應(yīng)情況的討論以及溫度對其的影響
　　研究中發(fā)現(xiàn)，在分離獲得的12株對蝦早期死亡綜合征的病原菌中，毒素基因的表達(dá)與毒力的對應(yīng)情況并不

9、好。對此發(fā)現(xiàn)初步分析后認(rèn)為可能是由于毒素基因表達(dá)的溫度與毒素感染對蝦的溫度不同，溫度的差異導(dǎo)致對蝦對于毒素的應(yīng)激反應(yīng)不同導(dǎo)致了該現(xiàn)象。因此設(shè)計了不同溫度對菌株感染能力影響的實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)選取37℃下毒力基因表達(dá)最強(qiáng)的F12號菌株和表達(dá)最弱的G10號菌株為研究對象。選取對蝦較為適宜生長的20-32℃為溫度范圍，每3℃設(shè)置一個梯度，對兩株菌在5個不同溫度下的毒力進(jìn)行攻毒測試。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的5個溫度梯度范圍內(nèi)，致病菌株的毒力隨