喉癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA篩選及分子標(biāo)簽建立.pdf

1、頭頸部鱗癌是第六位最常見惡性腫瘤，喉癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，在呼吸道腫瘤中發(fā)病率居第二位，以鱗狀細(xì)胞癌為主，約占95％。隨著工業(yè)化的發(fā)展和空氣污染的加重，喉癌在我國以及世界范圍內(nèi)其發(fā)病率呈逐步上升趨勢。有調(diào)查表明，喉癌的發(fā)病率不斷升高，每年約增加25％。而且，根據(jù)最新的研究，雖然近30年來新的外科手術(shù)方法、化療藥物、更先進(jìn)的放射治療手段以及靶向藥物已應(yīng)用在喉癌的治療中，喉癌患者的總生存率不但并未得到提高，甚至有下降的趨勢，

2、僅約50％，晚期喉癌的生存率更低達(dá)30～40％?？傮w治療效果仍難令人滿意。
　　 一般認(rèn)為，喉癌的不良預(yù)后通常與腫瘤晚期診斷、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前關(guān)于喉癌預(yù)后不良的相關(guān)因素的研究結(jié)果差異較大，進(jìn)一步了解影響喉癌術(shù)后生存和預(yù)后的密切相關(guān)因素，可為喉癌患者預(yù)后評估及個體化治療策略制定提供必要的依據(jù)。
　　 提高喉癌早期診斷率、復(fù)發(fā)傾向的早期預(yù)測及有效干預(yù)措施是進(jìn)一步提高喉癌療效的關(guān)鍵。盡管隨著影像技術(shù)的進(jìn)步以及高清內(nèi)鏡的普及

3、使用，可為臨床醫(yī)生提供了早期診斷喉癌的手段，然而傳統(tǒng)的喉癌病理診斷方法等是從細(xì)胞水平反映腫瘤的生物學(xué)特征，具有局限性，不能充分反映腫瘤的真實本質(zhì)。隨著分子醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，研究已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤在分子水平具有不同的表型，這種分子的變異譜與腫瘤的預(yù)后及療效預(yù)測相關(guān)。研究喉癌的分子機(jī)制并尋找特異的治療靶點是提高喉癌療效的關(guān)鍵。
　　 microRNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于多細(xì)胞生物中的小分子RNA，長度為

4、20-22個核苷酸，其本身不是編碼蛋白質(zhì)，它們是在轉(zhuǎn)錄后水平起調(diào)節(jié)作用。microRNA在人類基因組中只占整個基因組基因總數(shù)的2％左右，但可能有超過30％的基因受miRNA調(diào)控，越來越多的研究顯示微小RNA變異譜可能在腫瘤生物學(xué)行為過程中起非常重要的作用。每個miRNA可以控制數(shù)百個基因的表達(dá)，在基因組的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miRNAs調(diào)控腫瘤的生物學(xué)特性是可能作為抑癌基因，下調(diào)靶原癌基因的活性，也可作為促癌基因，下調(diào)靶抑癌

5、基因的活性。在不少疾病尤其明顯的是在腫瘤中，miRNA的表達(dá)譜具有一定的特征性改變。人們發(fā)現(xiàn)對不同腫瘤特定的miRNA水平進(jìn)行分析，有助于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估。miRNAs的研究為探索喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制、尋找新的診斷標(biāo)記物和治療靶點提供了很有前景的研究方向。
　　 最新的研究方法及技術(shù)主要包括生物信息學(xué)方法和先進(jìn)的基因芯片技術(shù)等實驗生物學(xué)方法為microRNA的研究提供了非常良好的手段。這些技術(shù)與方法已成功應(yīng)用于多種腫瘤的研

6、究中并顯示出其顯著地優(yōu)越性。
　　 喉癌的microRNA研究處于起步階段，目前在喉癌miRNA的相關(guān)研究仍存在許多不足之處:多為頭頸鱗癌的研究，單純喉癌研究很少，結(jié)果差異較大。既往的研究提示我們，可利用基因芯片等先進(jìn)高效的技術(shù)平臺篩選出喉癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA及其靶基因作為分子靶標(biāo)，以期建立喉癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床分子預(yù)測、監(jiān)測機(jī)制，及早干預(yù)，達(dá)到臨床防治喉癌復(fù)發(fā)、提高療效及改善患者預(yù)后的目的。本課題在規(guī)范化腫瘤標(biāo)本收

7、集和保存的基礎(chǔ)上，采用基因芯片技術(shù)篩選分析與喉癌不良預(yù)后相關(guān)的microRNA及其靶基因并進(jìn)行驗證，以期尋找出可能的生物標(biāo)記物。研究主要分為以下幾部分。
　　 第一章喉癌規(guī)范化標(biāo)本庫的建立與管理
　　 目的:建立規(guī)范化的喉癌標(biāo)本庫，為喉癌的科學(xué)研究提供高質(zhì)量的標(biāo)本，并進(jìn)行信息化管理。
　　 方法:采集并保存喉癌組織和血標(biāo)本，定期提取部分標(biāo)本總RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定，對病人進(jìn)行隨訪，收集喉癌病人臨床病理信息、標(biāo)本信息、

8、生存狀況、復(fù)發(fā)情況、術(shù)后喉功能等資料并通過電腦軟件進(jìn)行信息化管理。
　　 結(jié)果:從建立喉癌標(biāo)本庫至2012年12月，共成功收集147例配對的喉癌/癌旁正常組織標(biāo)本和82例血漿及血清標(biāo)本，質(zhì)量鑒定顯示標(biāo)本質(zhì)量良好。建立并完善了標(biāo)本的采集、處理、保存以及信息化管理的標(biāo)準(zhǔn)化流程。建立了喉癌病人全面、準(zhǔn)確的信息庫，提高了標(biāo)本管理和使用的效率和準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)論:喉癌規(guī)范化標(biāo)本庫的建立對喉癌的研究具有重要的價值，有助于保護(hù)寶貴的

9、生物醫(yī)學(xué)資源。標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)本采集、處理保存、信息化管理為喉癌研究提供了高質(zhì)量的標(biāo)本，保證其順利進(jìn)行發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　 第二章喉鱗癌患者手術(shù)治療后的預(yù)后因素回顧性分析
　　 目的:探討影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后生存和預(yù)后的最重要因素。
　　 方法:收集在廣東省人民醫(yī)院治療的205例接受喉全切除術(shù)、喉部分切除術(shù)或顯微喉鏡下CO2激光切除術(shù)的喉鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床和隨訪資料，應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，

10、通過Cox比例風(fēng)險模型對影響患者預(yù)后的因素進(jìn)行多元回歸分析。
　　 結(jié)果:腫瘤分型中，69.8％的病例為聲門型和30.2％為聲門上型。多數(shù)患者為N0(77.6％)，22.4％的患者為N1-N3。超過半數(shù)患者為T1-T2期(55.1％)，20.0％為T3期，24.9％為T4期。中位隨訪時間為49.2個月。術(shù)后第1，2，3年的生存率分別為99.0％，91.7％和81.5％。Ⅳ期患者的生存率低于Ⅰ期和Ⅱ期者(分別為p＜0.001和p=

11、0.013)。術(shù)后第1，2，3年的無進(jìn)展生存率分別為83.9％，74.6％和71.2％。而且，Charlson評分為1-2或≥3的患者相對Charlson評分為0者有更高的死亡率(HR分別為1.8和2.41，p=0.042和p=0.008)。多因素分析顯示臨床分期、外科切緣及同病與患者的死亡率和無疾病進(jìn)展生存率顯著相關(guān)。
　　 結(jié)論:外科切緣、臨床分期及同病是影響喉癌患者預(yù)后的獨立因素，晚期、切緣陽性者、嚴(yán)重同病患者的生存率顯著

12、降低，提示了喉癌早診早治、獲得手術(shù)切緣陰性以及同病狀況對預(yù)后的重要性。
　　 第三章利用基因芯片技術(shù)檢測喉癌組織中差異表達(dá)的miRNAs
　　 目的:篩選并分析喉癌組織與周圍正常喉黏膜的微小RNA(micro-RNAs，miRNAs)之間的表達(dá)譜差異，為進(jìn)一步研究miRNA與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供線索。
　　 方法:收集喉癌組織和癌旁正常喉黏膜標(biāo)本共10對，應(yīng)用Invitrogen公司的TRIzol和QIAGE

13、N公司的miRNeasy mini kit試劑盒抽提總RNA，使用nanodrop公司的分光光度計ND-1000測定RNA的質(zhì)量和定量，RNA的完整性由凝膠電泳判定。使用丹麥Exiqon公司的miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit，進(jìn)行miRNA標(biāo)記。在熒光標(biāo)記后進(jìn)行雜交。用Axon GenePix4000B microarray scanner(Axon)進(jìn)行掃描。掃描得到的圖像輸入GeneP

14、ix Pro6.0(Axon)軟件進(jìn)行坐標(biāo)調(diào)整和數(shù)據(jù)提取對喉癌中的miRNA差異表達(dá)進(jìn)行篩選。根據(jù)差異表達(dá)的比值，閾值大于2倍以上為上調(diào)，小于0.5倍為下調(diào)。采用SAM軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。
　　 結(jié)果:通過miRNA芯片篩選，我們得到了2662個差異表達(dá)的miRNA，將其中的非人類miRNA以及超過一半樣本無法檢測到的miRNA去除后，發(fā)現(xiàn)了780個miRNA有差異表達(dá)，其中277個microRNA表達(dá)上調(diào)，503個microR

15、NA表達(dá)下調(diào)。我們對芯片分析結(jié)果獲得的780個miRNA進(jìn)一步采用SAM軟件分析，設(shè)定FDR為0.05，經(jīng)校正后在喉癌組織中共有11個miRNA表達(dá)顯著上調(diào);114個miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。
　　 結(jié)論:1.基因芯片技術(shù)篩選喉癌特征性microRNA表達(dá)譜是可行的。2.對芯片結(jié)果的分析需注意統(tǒng)計學(xué)的多種檢驗問題，因此應(yīng)做錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正。3.基因芯片結(jié)果存在一定假陽性，需其他方法進(jìn)一步驗證。
　　 第四章應(yīng)用實時

16、熒光定量PCR(qRT-PCR)對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證
　　 目的:驗證基因芯片篩選結(jié)果的可靠性
　　 方法:從32例喉癌病人的腫瘤及癌旁正常組織用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過實時熒光定量PCR的方法，采用Sybr-Green染料法，以U6為內(nèi)參基因，對于芯片結(jié)果中顯著下調(diào)的microRNA中選取let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、m

17、iRNA-195-5p、miRNA-203的表達(dá)量進(jìn)行檢測。Bio-Rad CFX96 Manager軟件分析，GraphPad軟件作圖。
　　 結(jié)果:對let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203等6個表達(dá)下調(diào)的miRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗證，這6個miRNA在32對喉癌與周圍正常喉黏膜組織之間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義其中m

18、iRNA-125a-5p、miRNA-144-3p和miRNA-203最顯著。
　　 結(jié)論:實時熒光定量PCR(qRT-PCR)的結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，基因芯片結(jié)果是可靠的。
　　 第五章觀察篩選出的目標(biāo)microRNA對喉癌Hep2細(xì)胞株增殖及轉(zhuǎn)移、侵襲的作用研究
　　 目的:選取了在芯片實驗中及qRT-PCR中已驗證的顯著下調(diào)的miR-144-3p在喉癌細(xì)胞株Hep-2進(jìn)行體外實驗，觀察其對喉癌細(xì)胞的增殖、

19、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響及尋找其可能的靶基因。
　　 方法:1.利用生物信息學(xué)查找出mir-144-3p的可能靶基因。2.應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過MTT實驗、克隆形成實驗及細(xì)胞周期檢測觀察miR-144-3p對喉癌細(xì)胞的增殖的影響。3.通過Transwell侵襲實驗、3D-Culture、劃痕實驗，觀察喉癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。4.綜合運(yùn)用了qRT-PCR、Westernblot技術(shù)、GFP報告基因、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)研究了喉癌

20、細(xì)胞中miR-144-3p對于可能靶基因的調(diào)控作用。
　　 結(jié)果:1.利用生物信息學(xué)查找出mir-144-3p的可能靶基因為ETS-1。2.miR-144-3p可使喉癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。3.miR-144-3p可使ETS-1表達(dá)下調(diào)。4.miR-144-3p可使上皮分子標(biāo)志物(E-Cadherin，α-catenin)的表達(dá)升高，間質(zhì)分子標(biāo)志物（Fibronectin，Vimentin等）表達(dá)降低。
　　 結(jié)

21、論:1.miR-144-3p在喉癌組織中表達(dá)下調(diào)，提示了其在喉癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。2.miR-144-3p可能是通過作用于其下游的靶基因ETS-1對喉癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移起抑制作用，同時miR-144-3p有抑制喉癌細(xì)胞的增值的作用。3.miR-144-3p可能是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)影響喉癌Hep2細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移的。
　　 第六章ETS-1的表達(dá)與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系
　　 目的:觀察轉(zhuǎn)錄因子ETS-1

22、在喉鱗癌組織中的表達(dá);探討其在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及與預(yù)后的關(guān)系和意義。
　　 方法:采集54例配對喉癌、癌旁正常組織及34例不典型增生石蠟組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)分別檢測其ETS-1的表達(dá)，并對喉癌病人每三個月進(jìn)行隨訪，至少隨訪三年，收集喉癌病人臨床病理信息、生存狀況等資料。另外采集8例配對新鮮冰凍喉癌、癌旁正常組織，采用qRT-PCR及Western blot進(jìn)一步驗證ETS-1在喉癌中的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果

23、:ETS-1在喉癌組織和不典型增生中呈表達(dá)陽性者均顯著高于癌旁正常組織(P＜0.001)。ETS-1的表達(dá)水平高低與臨床分期、T分期、甲狀軟骨受侵、病理分化顯著相關(guān)(P＜0.05)，而與性別、年齡、N分期、腫瘤分型無關(guān)(P＞0.05);ETS-1蛋白低表達(dá)的患者其總生存率要明顯高于ETS-1蛋白高表達(dá)患者。新鮮標(biāo)本中的qRT-PCR及Western blot實驗結(jié)果進(jìn)一步證實了ETS-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)。
　　 結(jié)論:E