病原體特異性核酸序列標(biāo)簽篩選流程的建立及標(biāo)簽qPCR陣列驗證.pdf

1、病原體的檢偵是傳染病防控的重要環(huán)節(jié)，面對上千種已知和未知病原體，傳統(tǒng)的病原體分離培養(yǎng)存在盲目性，通量低，周期較長，病原體的確認需要流行病學(xué)、病原學(xué)、血清學(xué)、形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)等多方面證據(jù)。且有的病原體無法分離培養(yǎng)，有的病原體沒有易感的動物模型可以驗證。如果在傳染病發(fā)生的早期先對病原體核酸或蛋白進行快速高通量檢偵，縮小可疑感染病原體的鑒別范圍，可為后續(xù)病原體分離鑒定、血清學(xué)檢測、臨床診斷和對癥治療提供方向。
　　隨著二代測序技術(shù)的

2、廣泛應(yīng)用，物種和病原體基因組信息呈爆炸性增長，基因組大數(shù)據(jù)的挖掘和利用成為生物、醫(yī)藥領(lǐng)域大數(shù)據(jù)應(yīng)用的前沿領(lǐng)域。要實現(xiàn)病原體的高通量快速檢偵，基礎(chǔ)則在于構(gòu)建完整、高效的病原體標(biāo)簽序列數(shù)據(jù)庫，所謂病原體標(biāo)簽序列(signature)，是指能夠用來檢測病原體存在和能區(qū)分其與其它病原體的特異性核酸序列。而要構(gòu)建完整、高效的病原體標(biāo)簽序列數(shù)據(jù)庫，則必須通過基于大數(shù)據(jù)的智能計算過程，建立適合的算法和標(biāo)簽序列比對及輸出流程。
　　本研究以衛(wèi)生部

3、2006年發(fā)布的《人間流傳的主要致病微生物》目錄、羅恩杰主編《病原生物學(xué)》、李凡和徐志凱主編《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》[6,7]，列出當(dāng)前主要致病567種病原體目錄為基礎(chǔ)，結(jié)合16S序列專業(yè)庫 Silva(http://www.arb-silva.de/contact/)、細菌致病基因VFDB庫(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)、耐藥基因ARDB庫(http://ardb.cbcb.umd.edu/)，旨在摸索

4、構(gòu)建出一套高效實用的病原體特異性核酸標(biāo)簽篩選體系。并在篩選體系基礎(chǔ)上，提出分級標(biāo)簽策略，即：屬標(biāo)簽+種標(biāo)簽+致病基因標(biāo)簽+耐藥基因標(biāo)簽共同表征/定義病原體，最終實現(xiàn)多靶點全覆蓋達到一次性檢測所有病原體及其致病耐藥特征的理想目標(biāo)。通過研究，取得了如下階段性成果：
　　1）在MUMmer+Insignia基礎(chǔ)上摸索建立了核酸特異性標(biāo)簽自主篩選流程TMMU signature workflow，并實現(xiàn)流程可視化。流程將比對背景縮小到所有

5、目標(biāo)病原體核酸序列集合，同時為加快MUMmer匹配后Insignia過程，對文件按照Taxon進行了切分。為減少特異性標(biāo)簽流失，將BLAST庫設(shè)為Nt庫與WGS序列庫集合，并剔除其中所有人工合成序列。BLAST篩選設(shè)置兩個重要參數(shù)，一是按名稱（雙重）判定是否同種病原體，二是將覆蓋度設(shè)為90％，即標(biāo)簽若與其它物種序列覆蓋度達到90%，則標(biāo)簽判定為不特異；
　　2）通過多種計算驗證，TMMU signature workflow精確計

6、算流程不適于細菌屬標(biāo)簽比對（無論是基于16S序列，還是基于屬間全基因組序列），屬標(biāo)簽可利用clustal Omega找到屬保守區(qū)段，再通過多條標(biāo)簽檢測來覆蓋個別堿基差異，達到提示病原體屬存在的檢偵結(jié)果；
　　3）TMMU signature workflow精確計算流程不僅適用于有全基因組的DNA序列，也適用于有全基因組的RNA序列。同時還適用于短序列（16S序列除外，同屬間辨識度不夠，無法區(qū)分到種），沒有全基因組的病原體和致病基

7、因、耐藥基因片段序列，也可通過同種、同基因短序列間不求交策略進入流程獲得特異性標(biāo)簽序列；
　　4）建立了15種高致病出血熱病毒qPCR陣列和29種分枝桿菌qPCR陣列，經(jīng)驗證以ZEBOV為代表的高致病出血熱病毒qPCR陣列，陽性質(zhì)粒5×107-5×101拷貝/μl做標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù) R2＞0.99，靈敏度可達5×101拷貝。準(zhǔn)確性重復(fù)性實驗結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)（CV）為0.88%-2.50%、批間CV為1.75%-3.31%。以結(jié)核桿

8、菌等為代表的29種分枝桿菌qPCR陣列，陽性質(zhì)粒5×107-5×103拷貝/μl做標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，靈敏度可達5×103拷貝。兩條結(jié)核桿菌探針，23例結(jié)核桿菌痰涂陽性樣本檢測均陽性，20例結(jié)核桿菌痰涂陰性患者檢測均陰性，特異性100%，敏感性100%。以9例GeneX-pert MTB（賽沛）檢測陽性樣本為對照，1號探針檢測有7個樣本陽性，2號探針檢測有7個樣本陽性，兩條探針陽性結(jié)果不完全重疊，出現(xiàn)互補，共有8個樣本陽性。