IgA腎病尿沉渣特異性miRNAs篩選與驗證及其細胞來源分析.pdf

1、背景和目的:IgA腎病(IgA nephrophathy, IgAN)是我國最常見的慢性腎臟病,也是導(dǎo)致我國終末期腎臟疾病(尿毒癥)的最主要病因。多數(shù)IgAN是進展性疾病,因此,臨床上需要能及時反映IgAN病情變化的生物標志物用以診斷、評估病情、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。尿沉渣miRNA是2010年以來尋找IgAN標志物新的方向,國內(nèi)外也有學(xué)者開展了有益的嘗試,發(fā)現(xiàn)某些miRNAs與IgAN的臨床病理和預(yù)后有一定相關(guān)。但由于是單中心、小樣本研

2、究,對IgAN疾病特征反映并不全面。本課題第一次利用miRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),高通量篩選IgAN新的miRNA分子標志物,進而通過熒光定量PCR驗證,篩選出幾種IgAN特異性的miRNA標志物,評估其對IgAN診斷及病情判斷中的作用。進一步明確上述miRNAs標志物在尿沉渣中的具體細胞來源及其可能的作用,為IgAN無創(chuàng)診斷研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:收集中國人民解放軍總醫(yī)院腎臟病科2012年11月至2014年1月首次經(jīng)腎活檢

3、證實的IgAN患者。正常對照組為年齡性別匹配的健康人。疾病對照組為首次經(jīng)腎活檢證實的非IgAN原發(fā)性腎小球疾病患者。在腎活檢前留取尿液標本,通過離心分離尿沉渣和尿液上清。腎臟病理采用Lee氏分級和半定量評分。1、尿沉渣miRNA芯片檢測:提取尿沉渣總RNA,利用安捷倫公司miRNA芯片V19.0對9個IgAN患者(3個LEE氏II級,3個III級和3個IV-V級)和3個正常人進行差異 miRNAs篩選。并與文獻報道的 IgAN腎組織和外

4、周血白細胞的 miRNAs芯片結(jié)果進行對比分析,明確三組不同樣本來源miRNAs表達趨勢的異同。2、尿沉渣miRNA標志物的驗證與臨床病理相關(guān)分析:利用SYBR Green熒光定量PCR,擴大樣本人群,檢測尿沉渣miRNAs在84個IgAN患者、29個正常人和21個疾病對照組患者中的表達差異。繪制ROC曲線(receiver operating characteristic curve,受試者作業(yè)特征曲線)評估幾種標志物診斷IgAN的敏

5、感度和特異度。并分析其與IgAN臨床、病理指標的相關(guān)關(guān)系。3、利用磁珠分離尿紅細胞和尿上清液微泡提取等技術(shù),確定miRNAs標志物的具體細胞來源,并分析其可能的生物學(xué)作用。
　　結(jié)果:1.利用高通量miRNAs芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),篩選出IgAN組和正常對照組尿沉渣差異表達的miRNAs共214個。此外還發(fā)現(xiàn)有92個miRNAs在IgAN不同病理分級間(LEE氏II級,III級和IV-V級)有表達差異。通過與文獻報道的IgAN腎

6、組織和外周血白細胞的miRNAs芯片結(jié)果進行對比分析,發(fā)現(xiàn)三種樣本來源miRNAs的表達趨勢異同。尿沉渣與腎組織miRNAs芯片結(jié)果相比,有54.55％的miRNAs趨勢一致,33.78%趨勢相反。與外周血白細胞芯片結(jié)果對比,有48.65%的miRNAs趨勢相同,2個miRNAs趨勢相反。匯總?cè)齻€芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn), miR-98,miR-148b,let-7d,miR-374b,miR-17和miR-502-3p在三個miRNA芯片結(jié)果中都

7、有顯著差異。
　　2. IgAN組的尿沉渣miR-25、miR-144、miR-486表達量顯著高于正常對照組和疾病對照組,而IgAN組miR-135a和miR-150表達水平則顯著低于正常對照組。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486是IgAN的特異性生物標志物,其聯(lián)合診斷IgAN的特異性達100%,敏感性為89.9%。此外,IgAN組miR-144、miR-486和miR-150在不同Lee氏分級的亞組中,表達量有

8、顯著差異,miR-144和miR-486在Lee氏III級中表達量最高,而miR-150則在Lee氏IV-V級中表達水平最高。miR-150與全球硬化呈正相關(guān)。而miR-144、miR-135a、miR-150與節(jié)段硬化呈正相關(guān)。MiR-486與新月體呈負相關(guān),而miR-135a則與新月體呈正相關(guān)。有腎血管病變組miR-486的表達量顯著高于無血管病變組。間質(zhì)纖維化輕度、中度、重度的3組間miR-150的表達量有顯著差異,重度纖維化組表

9、達量顯著高于輕度組和中度組。此外,還發(fā)現(xiàn)miR-135a、miR-25和miR-486與包曼囊壁節(jié)段增厚和分層有密切關(guān)系。在臨床指標中,miR-25、miR-144、miR-486、miR-150與Cys呈正相關(guān)。MiR-486、miR-150與Scr呈正相關(guān),且miR-486與eGFR呈負相關(guān)。
　　3.本研究首先發(fā)現(xiàn)miR-25、miR-144和miR-486在尿紅細胞滿視野組的表達量顯著高于非滿視野組。利用磁珠分離尿紅細胞技

10、術(shù)將紅細胞分離提純(紅細胞組)發(fā)現(xiàn)上述miRNAs表達量大大升高,而不含紅細胞組上述miRNAs表達量則顯著降低。正常人中上述miRNAs表達水平很低,在加入自身血紅細胞后尿沉渣上述miRNAs表達顯著增加。體外分離尿沉渣中含有的主要細胞成分,白細胞、紅細胞、腎小管上皮細胞,檢測miR-25、miR-144和miR-486的表達量,發(fā)現(xiàn)紅細胞中miRNAs的基線水平也顯著高于其他細胞。
　　4、IgAN組和正常對照組的血紅細胞mi

11、R-144和miR-486的表達量無顯著差異,而IgAN組miR-25的表達顯著低于正常對照組。向IgAN患者尿上清液中加入患者自身血紅細胞,制造外科性血尿模型,發(fā)現(xiàn)IgAN尿紅細胞miR-25、miR-144和miR-486的表達量顯著高于外科性血尿模型組。進一步實驗還發(fā)現(xiàn),IgAN組尿上清液微泡中miR-144和miR-486表達量顯著高于正常對照組,且微泡中miR-486相對表達量很高。
　　5、本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),miR-25

12、和miR-486這兩個紅細胞來源的miRNAs與包曼囊壁節(jié)段增厚和分層密切相關(guān),有節(jié)段增厚和分層組miR-25和miR-486的表達量顯著升高。本研究納入的IgAN患者中,有71.43%存在包曼囊壁節(jié)段增厚和分層,顯著高于疾病對照組的9.52%。這與尿沉渣中IgAN組miR-25和miR-486表達量顯著高于疾病對照組一致。IgAN尿紅細胞滿視野伴尿蛋白陽性者包曼囊彌漫性增厚組的腎小球比例為72.34%,高于尿紅細胞非滿視野伴尿蛋白陽性

13、組的54.5%。
　　結(jié)論:本研究采用miRNA芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析了IgAN尿沉渣miRNAs表達譜,并發(fā)現(xiàn)與來源于腎組織及外周血白細胞表達譜的異同。進而篩選出可用于無創(chuàng)診斷IgAN的miRNAs,不僅具有病疾病診斷特異性,而且與臨床、病理指標有良好相關(guān)性。尿沉渣miR-25、miR-144和miR-486主要來源于尿中紅細胞,與包曼囊壁增厚和分層密切相關(guān)。尿紅細胞miRNA可能通過微泡釋放,發(fā)揮生物學(xué)作用,參與IgAN的