miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新.pdf

1、研究目的
　　 1.篩選小細(xì)胞肺癌中干細(xì)胞與非干細(xì)胞差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNAs。
　　 2.探討關(guān)鍵miRNAs對(duì)H446細(xì)胞體外自我更新能力的影響。
　　 研究方法
　　 1.課題組前期工作證明小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446腫瘤球中富集了干細(xì)胞樣細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過無血清培養(yǎng)技術(shù)在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446、H209和H69中獲得第四代腫瘤球細(xì)胞。
　　 2.利用microRNA芯片技術(shù)，檢測(cè)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

2、系中干細(xì)胞和非干細(xì)胞的microRNA表達(dá)譜，篩選出兩群細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNAs。
　　 3.利用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)，分析差異表達(dá)miRNAs的種子序列。
　　 4.根據(jù)較大差異倍數(shù)及其他篩選策略進(jìn)一步篩選miRNAs。
　　 5.應(yīng)用qRT-PCR方法，在上述三個(gè)細(xì)胞系的干細(xì)胞和非干細(xì)胞中驗(yàn)證其表達(dá)，并選定三個(gè)細(xì)胞系中恒定差異表達(dá)的miRNAs作為關(guān)鍵miRNAs。
　　 6.利用轉(zhuǎn)染技術(shù)，降低或

3、升高關(guān)鍵miRNAs的表達(dá)水平后，進(jìn)行腫瘤球形成、克隆形成和MTT實(shí)驗(yàn)，了解關(guān)鍵miRNA對(duì)H446細(xì)胞體外自我更新和增殖的影響;通過免疫熒光染色，檢測(cè)uPAR和CK的表達(dá)，了解其對(duì)細(xì)胞分化的影響。
　　 7.利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，分析關(guān)鍵miRNA和一些種子序列相同的重要miRNAs可能調(diào)控的靶基因，篩選出調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的靶基因。
　　 結(jié)果
　　 1.小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446干細(xì)胞與非干

4、細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜microRNA芯片結(jié)果顯示:第四代腫瘤球細(xì)胞和親代細(xì)胞之間相比，有86個(gè)差異表達(dá)的miRNAs(P＜0.01)，其中48個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，38個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。
　　 2.小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞與非干細(xì)胞差異表達(dá)的關(guān)鍵miRNA
　　 (1)差異表達(dá)miRNAs的種子序列分析:鑒于miRNAs的種子序列直接介導(dǎo)miRNAs與其靶基因的相互作用，因此，我們進(jìn)一步分析了上述86個(gè)差異表達(dá)miRN

5、As的種子序列，并將具有相同種子序列的miRNAs歸為一組。結(jié)果顯示:86個(gè)miRNAs中具有相同種子序列的miRNAs有29個(gè)，共組成9組。
　　 (2)進(jìn)一步篩選miRNAs:86個(gè)差異表達(dá)的miRNAs中，根據(jù)上述篩選策略，篩選出6個(gè)miRNAs，其中l(wèi)et-7、miR-20、miR-21、miR-27a和miR-30b表達(dá)下調(diào)，miR-149*表達(dá)上調(diào)。
　　 (3)驗(yàn)證并最后選定關(guān)鍵miRNAs: qRT-PC

6、R結(jié)果顯示6個(gè)miRNAs在三個(gè)細(xì)胞系的腫瘤球細(xì)胞和親代細(xì)胞之間的表達(dá)水平確有差異，證實(shí)了microRNA芯片結(jié)果;但是，僅miR-27a在三個(gè)細(xì)胞系的腫瘤球中恒定低表達(dá)，其余5個(gè)miRNAs在三個(gè)細(xì)胞系的腫瘤球中表達(dá)趨勢(shì)不一致。
　　 3.miR-27a調(diào)控H446細(xì)胞體外自我更新
　　 (1) miR-27a下調(diào)增加腫瘤球形成和克隆形成:在親代細(xì)胞H446中轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑下調(diào)miR-27a的表達(dá)，體外無血清

7、成球?qū)嶒?yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑的細(xì)胞形成更多的腫瘤球和細(xì)胞集落。就形態(tài)而言，轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑組形成的腫瘤球更大。
　　 (2) miR-27a下調(diào)增強(qiáng)細(xì)胞增殖:轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑和陰性對(duì)照后，通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h和72 h，細(xì)胞活力明顯高于轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的細(xì)胞。
　　 (3) miR-27a下調(diào)抑制細(xì)胞分化:

8、將轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑和陰性對(duì)照的細(xì)胞培養(yǎng)72 h后進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染miR-27a抑制劑顯著增加了uPAR+細(xì)胞和CK-細(xì)胞的數(shù)目。
　　 4.靶基因預(yù)測(cè)
　　 通過miRNAs靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScan5.1（http://www.targetscan.org/），篩選出了與細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期相關(guān)的基因。如miR-27a調(diào)節(jié)的與細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期相關(guān)的靶基因有BCLAF1、B

9、AK1和CCNG1，miR-27b調(diào)控的與細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞周期相關(guān)靶基因有BAK1和CCNG1。
　　 結(jié)論
　　 1.小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446干細(xì)胞和非干細(xì)胞的miRNAs表達(dá)存在差異。
　　 2.miR-27a是小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞的關(guān)鍵miRNA，低水平的miR-27a可能是小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞的內(nèi)在特征。
　　 3.miR-27a下調(diào)增加H446細(xì)胞體外自我更新能力，降低細(xì)胞分化。
　　 總