Myostatin自體疫苗的研究.pdf

1、Myostatin(Mstn或Ms)屬于TGF-β超家族新成員，主要在骨骼肌中表達(dá)。Myostatin是骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，抑制myostatin的功能可明顯提高骨骼肌質(zhì)量。基因敲除myostatin的小鼠肌纖維有明顯的增生和增粗，脂肪含量隨年齡的增長(zhǎng)而明顯降低。抑制myostatin活性的蛋白如其前肽、follistatin蛋白、ActRⅡB非活性結(jié)構(gòu)域蛋白高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠體重和骨骼肌質(zhì)量明顯提高。Myostatin蛋白酶切

2、加工位點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)基因小鼠，同樣顯示小鼠體重增加。而抗myostatin單克隆抗體處理的杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良模型小鼠(DMD)，骨骼肌質(zhì)量和力量明顯增加，患病的小鼠癥狀明顯改善，證實(shí)了myostatin作為骨骼肌生成負(fù)調(diào)節(jié)因子對(duì)成年動(dòng)物也有作用，并為myostatin單克隆抗體用于臨床骨骼肌發(fā)育抑制性疾病的治療提供了依據(jù)。 雖然針對(duì)myostatin蛋白的單克隆抗體在治療肌肉相關(guān)疾病的過(guò)程中顯示出了良好的效果，但是，造價(jià)的昂貴和使用上的

3、不便限制了單克隆抗體的廣泛應(yīng)用，因此，由被動(dòng)地接受這種抗體蛋白轉(zhuǎn)向?qū)で筢槍?duì)該蛋白的主動(dòng)免疫疫苗有更好的應(yīng)用前景。本課題擬構(gòu)建能夠誘導(dǎo)出針對(duì)myostatin特異性中和抗體的治療性疫苗，為肌肉相關(guān)疾病治療提供新的途徑。 我們利用合成基因的方法人工合成了myostatinC-未端區(qū)(109個(gè)氨基酸)基因序列，構(gòu)建了針對(duì)myostatin的基因疫苗和蛋白疫苗兩種治療性疫苗。為了打破myostatin疫苗的免疫耐受和加強(qiáng)疫苗免疫原性，我

4、們?cè)跇?gòu)建myostatin蛋白疫苗和基因疫苗時(shí)在其N-端插入了來(lái)源于破傷風(fēng)毒素的具有激活Th細(xì)胞作用的通用Th細(xì)胞表位TT830-844，以增強(qiáng)myostatin兩種治療性疫苗的免疫效果。利用抗原表達(dá)載體對(duì)抗原免疫原性的影響，我們構(gòu)建基因疫苗時(shí)選用了基因疫苗專用質(zhì)粒pVAC1-cms，構(gòu)建蛋白疫苗選用了融合表達(dá)6His的質(zhì)粒pQE30，以提高表達(dá)蛋白的免疫原性。 蛋白疫苗構(gòu)建結(jié)果顯示，我們?cè)诖竽c桿菌中成功地克隆、表達(dá)了His-M

5、s和His-TT-Ms融合蛋白，兩種蛋白均以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)鎳親和色譜層析柱純化后，獲得了純度在90％左右的目的蛋白，純化后的蛋白作為候選疫苗免疫動(dòng)物?；蛞呙鐦?gòu)建結(jié)果顯示，融合了TT表位的myostatin成熟肽，與質(zhì)粒pVAC1-cms重組后，在CHO細(xì)胞中明顯表達(dá)，OD260/280比值和電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms基因疫苗符合免疫動(dòng)物的質(zhì)量要求。兩種候選疫苗在小鼠身上進(jìn)行了免疫試驗(yàn)，融合TT表位的基因疫苗和蛋白疫

6、苗均誘導(dǎo)出myostatin特異性中和抗體(滴度約2×103)。候選基因疫苗和蛋白疫苗免疫的動(dòng)物體重增加，肌細(xì)胞有肥大現(xiàn)象，肌肉質(zhì)量和前肢握力明顯增加。與正常對(duì)照組比較，基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫的動(dòng)物平均體重增加了9.8％，股四頭肌、腓腸肌和胸大肌分別增加了24.1％、10.9％和20.3％，前肢握力增加了30.9％；蛋白疫苗His-TT-Ms免疫動(dòng)物平均體重增加了5.6％，股四頭肌、腓腸肌和胸大肌分別增加了18.4％、8.4％

7、和16.7％，前肢握力增加了29.6％。His-Ms蛋白免疫小鼠后各指標(biāo)均不如His-TT-Ms蛋白免疫效果，進(jìn)一步說(shuō)明Th細(xì)胞表位TT830-844在增強(qiáng)免疫效果方面的作用。Myostatin蛋白疫苗和基因疫苗動(dòng)物免疫結(jié)果分析表明，myostatin基因疫苗免疫效果略好于蛋白疫苗。 綜上所述，我們成功構(gòu)建了兩種候選的myostatin治療性疫苗，系統(tǒng)比較了基因疫苗和蛋白疫苗的免疫效果，為myostatin自體疫苗治療肌肉萎縮相