基于非天然氨基酸插入法構(gòu)建針對自體硬化蛋白的骨質(zhì)疏松疫苗.pdf

1、【背景】
　　骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種主要表現(xiàn)為骨骼骨量的減少、骨組織微細結(jié)構(gòu)的破壞，進而導致骨組織的脆性增加、骨骼強度的降低而易于發(fā)生骨折的全身性骨代謝障礙性疾病，多發(fā)生在老年和絕經(jīng)后的女性。正常骨組織形態(tài)的維持主要取決于兩個方面：成骨細胞和破骨細胞所發(fā)揮的成骨作用和骨吸收作用。這種耦聯(lián)機制一旦被打破，就會引起許多骨代謝相關(guān)性疾病。而在引起成骨作用和骨吸收作用耦聯(lián)失衡的諸多因素中，成骨細胞功能的減弱扮

2、演者及其重要的角色。
　　骨硬化蛋白(Sclerostin)是由 SOST基因調(diào)控，主要表達于骨細胞。骨硬化蛋白作用于成骨細胞表面的低密度脂蛋白相關(guān)蛋白復合受體( LRP5/6)，從而拮抗成骨細胞胞內(nèi)經(jīng)典Wnt信號通路，進而對成骨細胞的功能發(fā)揮明顯的負性調(diào)控作用?？构怯不鞍椎膯慰寺】贵w通過與骨硬化蛋白特異性結(jié)合，進而特異性拮抗骨硬化蛋白對成骨細胞的負性調(diào)控作用，從而明顯促進成骨細胞的骨形成作用，因此對骨代謝相關(guān)性疾病均有良好的治

3、療作用。但抗骨硬化蛋白單克隆抗體的制備工藝復雜，成本昂貴及抗體部分的不良反應(yīng)限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。而疫苗作為主動免疫,通過誘導機體產(chǎn)生特異性針對內(nèi)源性抗原的多克隆抗體也許是一個更好的策略。在主動免疫治療中，疫苗能否突破自體蛋白的免疫耐受，并產(chǎn)生能特異性高親和力結(jié)合自身蛋白抗原的抗體是其主要難點。本研究中，我們通過在骨硬化蛋白特定位點插入非天然氨基酸，從而有效突破了自體蛋白的免疫耐受，產(chǎn)生的高滴度抗體不僅能與突變型骨硬化蛋白結(jié)合，同時與

4、內(nèi)源性骨硬化蛋白也具有良好的交叉反應(yīng)。
　　本研究探討了小鼠非天然氨基酸突變型骨硬化蛋白的原核表達和純化，以及將其作為疫苗檢測非天然氨基酸突變型骨硬化蛋白疫苗在小鼠骨質(zhì)疏松模型(OVX)中的療效與可行性，為進一步優(yōu)化疫苗治療骨質(zhì)疏松癥奠定了基礎(chǔ)。
　　【方法和結(jié)果】
　　1.將經(jīng)過密碼子優(yōu)化后的小鼠mSOST基因，構(gòu)建 pET28a-mSOST重組表達載體，然后分別將編碼第115,121和126位氨基酸的密碼子（AAC

5、, AAG和AAC）定點突變?yōu)殓昝艽a子(TAG)，在pEVOL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的情況下，編碼p-硝基苯丙氨酸，然后將構(gòu)建成功的pET28a-pNO2Phe mSOST重組表達載體送公司進行雙向測序鑒定。
　　2.野生型和 p硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白的表達和純化。誘導表達的菌體經(jīng)裂解后進行SDS-PAGE與 Western Blot檢測，結(jié)果表明，p硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白在原核蛋白表達系統(tǒng)內(nèi)成功表達。通過Ni-NTA親和層析介

6、質(zhì)對骨硬化蛋白進行純化，純化后的骨硬化蛋白用超濾管進行蛋白濃縮。將濃縮后的骨硬化蛋白進行高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測。結(jié)果表明，野生型骨硬化蛋白在特定位點成功插入了p-硝基苯丙氨酸。
　　3.以純化的野生型和p硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白免疫C57/BL雌性小鼠，最后一次免疫結(jié)束后第7天尾靜脈取血，靜置，去上層血清?？寡寤钚杂每寡搴凸怯不鞍椎慕Y(jié)合實驗來驗證。而血清抗體滴度的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附實驗。結(jié)果表明，突變型骨硬化蛋白能突

7、破自身免疫耐受產(chǎn)生高滴度，高特異性抗體，該抗體不僅能與突變型骨硬化蛋白相結(jié)合，同時與內(nèi)源性骨硬化蛋白也具有良好的交叉反應(yīng)。
　　4.驗證突變型骨硬化蛋白疫苗對骨質(zhì)疏松模型小鼠的治療效應(yīng)。通過 ELISA檢測評估整個實驗過程抗體滴度情況；通過血清學檢測（骨鈣素）骨形成情況以及顯微 CT技術(shù)檢測骨密度、骨微架構(gòu)等。結(jié)果顯示非天然氨基酸突變型骨硬化蛋白疫苗對OVX模型小鼠骨質(zhì)疏松有明顯的治療效果。
　　【結(jié)論】
　　本實驗中

8、，我們首次表達和純化了小鼠 p-硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白，并通過高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測驗證了野生型骨硬化蛋白特定位點（115,121和126）成功插入了p-硝基苯丙氨酸。然后將突變后的骨硬化蛋白免疫小鼠，檢測小鼠抗血清的活性，發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生的抗體與內(nèi)源性骨硬化蛋白有良好的交叉反應(yīng)。然后將純化的p-硝基苯丙氨酸突變型骨硬化蛋白作為疫苗，并在骨質(zhì)疏松癥模型(OVX)小鼠上驗證其治療效果。對小鼠血清成骨標志物以及micro-CT檢測，非天