含非天然氨基酸pPpa的水通道蛋白的制備及其濾水性能研究.pdf

1、水通道蛋白(Aquaporin，AQP)具有優(yōu)良的透水性能在生物仿生膜的制備領(lǐng)域有重要的應(yīng)用，但此類生物仿生膜普遍存在膜強(qiáng)度低和膜完整性差等缺點(diǎn)。因此，如何增強(qiáng)水通道蛋白與膜材料分子之間的結(jié)合能力已經(jīng)成為提高含AQP生物仿生膜完整性和穩(wěn)定性的技術(shù)關(guān)鍵。
　　本研究擬用非天然氨基酸改造水通道蛋白Z(AQPZ)與水通道蛋白SS9(AQPSS9)蛋白分子，改變其肽鏈結(jié)構(gòu)。首先定點(diǎn)突變詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannas

2、chii)的酪氨酸-tRNA合成酶tyrosyl-tRNA synthetase(TyrRS)，使其可催化對(duì)丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine，pPpa)合成對(duì)應(yīng)的氨酰tRNA。然后利用定點(diǎn)突變技術(shù)在AqpZ與AqpSS9基因特定位點(diǎn)中引入終止密碼子TAG。在此基礎(chǔ)上在大腸桿菌無細(xì)胞體系中實(shí)現(xiàn)含非天然氨基酸pPpa的AQPZ和AQPSS9的高效表達(dá)。通過優(yōu)化無細(xì)胞表達(dá)體系中鎂離子濃度，含pPp

3、a的AQPZ可溶表達(dá)量達(dá)到48mg/L。利用信號(hào)肽融合表達(dá)策略，含pPpa的AQPSS9可溶表達(dá)量達(dá)到49mg/L，并建立了親和層析純化目標(biāo)蛋白的分離工藝。
　　將改性后的水通道蛋白裝載到1，2-二油?；字Ｄ憠A(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)脂質(zhì)體中，經(jīng)停留光譜分析改性AQPZ的水滲透因子Pf值為3.42×10-4m/s，分別是天然AQPZ和DOPC脂質(zhì)體的2.7和

4、6.8倍;改性的AQPSS9的水滲透因子Pf值為7.46×10-4m/s，分別是天然AQPSS9和DOPC脂質(zhì)體的5.7和12.1倍，表明非天然氨基酸pPpa的嵌入并沒有影響疏通到蛋白的透水功能。
　　采用靜電吸附的方法制備嵌入有水通道蛋白的生物仿生膜，用截留反滲透裝置分析仿生膜的水通量和鹽截留率。結(jié)果顯示嵌入改性AQPZ的仿生膜的水通量為19.9L·m-2·h-1和鹽截留率達(dá)到68.3％，優(yōu)于天然AQPZ的性能（水通量:18.7

5、L·m-2·h-1，鹽截留率:60.7％）。改性AQPSS9嵌入的仿生膜的水通量為14.8L·m-2·h-1和鹽截留率達(dá)到48.3％，這與天然AQPSS9仿生膜的性能相當(dāng)。改性水通道蛋白的嵌入使仿生膜的水通量顯著提升，接近于基膜的通量，表明非天然氨基酸的嵌入沒有影響其透水功能。改性水通道蛋白比天然水通道蛋白在膜上表現(xiàn)更為優(yōu)異，可能是因?yàn)榉翘烊话被岬那度胧顾ǖ赖鞍着c磷脂的親和性增強(qiáng)，導(dǎo)致相同的條件下水通道蛋白的嵌入后更穩(wěn)定。本研究在無