LYG1在炎癥反應中的作用研究.pdf

1、人類基因組計劃的完成使我們對于基因有了進一步的認識，我們確定了基因組中的基因編碼序列，但是對于其功能卻知之甚少。因此生命科學的發(fā)展的重點也轉(zhuǎn)向了功能基因組學，基因的功能研究也因此成為研究熱點。通過研究篩選發(fā)現(xiàn)了一些對免疫細胞有調(diào)控作用的功能未知的新基因，LYG1就是其中之一。
　　LYG1定位于chr2q11.2，在各種屬之間同源性較高，為保守基因，編碼一個194個氨基酸的蛋白質(zhì)，編碼產(chǎn)物分子量21kDa，等電點(pI)8.168

2、。應用SignalP分析其N端的19個氨基酸是典型的信號肽，且沒有跨膜區(qū)域，推測LYG1蛋白是一個分泌型蛋白。LYG1在人體包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)的多種組織中均有表達，在免疫系統(tǒng)中表達稍高，可能參與炎癥的發(fā)生與發(fā)展，在抗病毒、抗胞內(nèi)病毒感染、抗腫瘤方面有著重要的應用價值。
　　目的:
　　建立小鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎模型，體外培養(yǎng)炎癥相關(guān)細胞，研究LYG1在炎癥反應中的作用。
　　方法:
　　1.體內(nèi)實驗
　　動物

3、模型建立及分組:BALB/C小鼠分為菌組(Kp)組20只、菌+蛋白組(LYG1+Kp)20只、正常組(Normal)10只。菌+蛋白組(LYG1+Kp)小鼠尾靜脈注射100μl濃度為1 ng/μl的LYG1蛋白，菌組(Kp)小鼠和正常組小鼠尾靜脈注射100μl的生理鹽水，1h后，注射20μl的生理鹽水到正常組小鼠氣管內(nèi)，菌+蛋白組(LYG1+Kp)和菌組(Kp)小鼠氣管內(nèi)注射20μl濃度為105cfu/mL的肺克菌。標本檢測:肺炎克雷伯

4、桿菌肺炎小鼠模型建立后的3h,6h,12h,24h四個時間點，取小鼠肺組織與外周血，使用HE染色進行病理學觀察，測定髓過氧化物酶(MPO)與誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的活性，免疫組化法、RT-PCR方法及蛋白免疫印跡法檢測炎性因子的表達。
　　2.體外實驗
　　細胞分組和處理:常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)。實驗分為PBS對照組、TNF-α陽性對照組(10ng/mL)、TNF-α(10ng/mL)+LYG1(1

5、0ng/mL)組、TNF-α(10ng/mL)+LYG1(100ng/mL)組和LYG1(100ng/mL)組。檢測方法:CCK-8法檢測LYG1蛋白對HUVECs細胞增殖的影響;實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法檢測LYG1蛋白對HUVECs細胞分泌炎性因子（IL-6、CXCL-2、MCP-1）及粘附分子水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1.體內(nèi)實驗結(jié)果
　　(1)小鼠肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)LYG1蛋白能減輕小鼠急性肺炎所造

6、成的肺損傷;(2)肺組織免疫組化顯示LYG1能抑制趨化因子GRO的表達;(3)肺組織勻漿MPO和血清iNOS活性檢測結(jié)果菌組+蛋白組的二者活性低于菌組，提示LYG1蛋白可以減弱小鼠肺炎模型中肺組織中性粒細胞的浸潤，減輕炎癥損傷;(4)肺組織炎性因子mRNA的PCR檢測發(fā)現(xiàn)菌+蛋白組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達均明顯低于菌組，顯示LYG1蛋白能夠降低肺組織細胞因子的mRNA表達水平，減弱肺部炎癥造成的肺損傷;(5)肺組織蛋白免疫

7、印跡法結(jié)果菌+蛋白組與菌組相比，NF-κB的表達水平有所降低，提示LYG1蛋白能降低炎癥狀態(tài)下NF-κB的表達水平，LYG1蛋白對炎癥的緩解可能是通過NF-κB通路實現(xiàn)的。
　　3.體外實驗結(jié)果
　　(1) CCK-8法檢測顯示LYG1蛋白對經(jīng)TNF-α誘導的HUVECs細胞增殖起到抑制作用，且抑制作用并沒有隨著蛋白濃度的增加而增強。(2)實時熒光定量PCR檢測HUVECs細胞炎性因子mRNA水平發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過TNF-α刺激后，

8、各組細胞的IL-6、MCP-1與CXCL2因子的mRNA水平的表達量均有所提高，加入LYG1蛋白，三種因子的表達量有所下降，LYG1蛋白對細胞的炎性因子分泌有一定的抑制作用。低濃度蛋白組比高濃度蛋白組對內(nèi)皮細胞分泌炎性因子的抑制作用更強。
　　(3)蛋白免疫印跡法檢測HUVECs細胞VCAM-1蛋白表達發(fā)現(xiàn)TNF+LYG1組與TNF組相比，VCAM-1表達量有所下降，結(jié)果提示LYG1蛋白能夠抑制粘附分子VCAM-1的表達，可能有抑