人類上皮性卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)CD4+CD25-CD45RA+初始T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分:
　　 目的：研究CD4+CD25-CD45RA+初始T細(xì)胞和CD4+CD25-CD45RA-T細(xì)胞群體靜息及激活狀態(tài)下叉頭框蛋白3(FOXP3)的表達(dá)，以探討不同群體細(xì)胞的可能性質(zhì)及同調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的內(nèi)在聯(lián)系。
　　 方法：采用磁珠分選人外周血淋巴細(xì)胞，使用CD4T細(xì)胞磁選分離試劑盒、CD25磁珠及CD45RA磁珠分離CD4+T淋巴細(xì)胞、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞、 CD4+

2、CD25-CD45RA+T淋巴細(xì)胞及CD4+CD25-CD45RA-T淋巴細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測其純度，并使用流式細(xì)胞儀檢測其FOXP3的表達(dá)。然后使用 CD3/CD28雙信號分別激活CD4+CD25-CD45RA+T淋巴細(xì)胞及CD4+CD25-CD45RA-T淋巴細(xì)胞3天，流式細(xì)胞儀檢測激活后的細(xì)胞FOXP3表達(dá)。
　　 結(jié)果：靜息狀態(tài)下的CD4+CD25-CD45RA+初始T細(xì)胞不表達(dá)FOXP3，即使使用CD3/CD28雙

3、信號激活后也很少細(xì)胞表達(dá)FOXP3，而CD4+CD25-CD45RA-T細(xì)胞在靜息狀態(tài)下少量細(xì)胞表達(dá)FOXP3，但是一旦激活，則高比例的細(xì)胞表達(dá)FOXP3。
　　 結(jié)論：不同亞型的T細(xì)胞具有不同的FOXP3表達(dá)模式，特別是在激活狀態(tài)下有明顯的區(qū)別。CD4+CD25-CD45RA+T細(xì)胞在未激活時不表達(dá)FOXP3，CD3/CD28雙信號刺激3天僅很少量的細(xì)胞表達(dá)FOXP3，適合作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外誘導(dǎo)實(shí)驗的靶細(xì)胞。
　　

4、第二部分：
　　 目的：研究激活后的CD4+CD25-CD45RA-T細(xì)胞的表型特征及功能，以明確激活的CD4+CD25-CD45RA-T細(xì)胞是否有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能及其抑制功能的變化。
　　 方法：采用磁珠分選人外周血淋巴細(xì)胞，首先采用陰性分選分離CD4+T淋巴細(xì)胞，然后使用CD25磁珠去除CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞，而CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞再使用CD45RA磁珠分離部分CD4+CD25-CD45RA+T淋

5、巴細(xì)胞，剩下的細(xì)胞作為CD4+CD25-CD45RA-T細(xì)胞分別采用各種方式進(jìn)行激活，激活后的細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀檢測其FOXP3的表達(dá)，然后將其同自身CD4+CD25-CD45RA+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，使用溴標(biāo)法檢測其抑制自身CD4+CD25-CD45RA+T淋巴細(xì)胞增生的能力。
　　 結(jié)果：不管是否有外源性的IL-2存在，使用CD3/CD28雙信號激活的CD4+CD25-CD45 RA-T細(xì)胞都有高比例的細(xì)胞表達(dá)FOXP3，而且

6、即使是CD3單信號激活，也有高比例的細(xì)胞表達(dá)FOXP3。中和IL-10及TGF-β并不能抑制其FOXP3的表達(dá)。進(jìn)一步的功能試驗表明，3天激活的CD4+CD25-CD45 RA-T細(xì)胞具有抑制功能。但是隨著激活時間的延長，其抑制能力減弱，抑制能力的減弱可能同大量細(xì)胞的凋亡有關(guān)。
　　 結(jié)論：人類外周血記憶性T細(xì)胞群體內(nèi)存在一類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的前體細(xì)胞，這部分細(xì)胞在靜息狀態(tài)下不表達(dá)FOXP3，一旦接受TCR信號的激活，特別是有合適的

7、共刺激信號存在的條件下，則快速表達(dá)FOXP3并且具有抑制功能，但激活后有快速凋亡的特征。
　　 第三部分：
　　 目的：研究上皮性卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清是否能夠誘導(dǎo)激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始細(xì)胞表達(dá)FOXP3并具有抑制功能及其內(nèi)在機(jī)制。
　　 方法：采用磁珠分選的方法分離高純度的人類CD4+CD25-CD45RA+初始T細(xì)胞，使用CD3/CD28雙信號激活的方法體外激活這些細(xì)胞并且在激活的同時在培養(yǎng)

8、基中加入一定比例的上皮性卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清，共培養(yǎng)3天，激活后的細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀檢測其FOXP3的表達(dá)并使用溴標(biāo)法細(xì)胞共培養(yǎng)試驗觀察其抑制功能。我們也在培養(yǎng)系統(tǒng)中分別加入幾種細(xì)胞因子的特異性抗體，以觀察其對FOXP3表達(dá)的影響。最后我們使用細(xì)胞因子模擬或者改變卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子構(gòu)成的方法觀察其對FOXP3表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：我們使用了2個上皮性卵巢癌的細(xì)胞株及5個原代培養(yǎng)的上皮性卵巢癌細(xì)胞，同時使用一個正常的卵

9、巢上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清作為對照。發(fā)現(xiàn)所有的上皮性卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清均能誘導(dǎo)激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始細(xì)胞表達(dá)FOXP3，而正常卵巢上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清沒有這個能力。隨后的共培養(yǎng)抑制試驗表明這些細(xì)胞具有抑制功能。細(xì)胞因子中和試驗發(fā)現(xiàn)中和IL-1O及TGF-β及IL-4均不能抑制激活的CD4+CD25-CD45RA+T初始細(xì)胞表達(dá)FOXP3，而LIF中和抗體部分抑制其FOXP3表達(dá)，但是LIF單獨(dú)并不能誘導(dǎo)激活后的CD4+CD25

10、-CD45RA+T初始細(xì)胞表達(dá)FOXP3。在培養(yǎng)系統(tǒng)中加入IL-6也不影響卵巢癌細(xì)胞上清誘導(dǎo)的FOXP3表達(dá)。
　　 結(jié)論：人類上皮性卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠誘導(dǎo)激活的人類CD4+CD25-CD45RA+初始T細(xì)胞表達(dá)FOXP3，并具有抑制自身免疫細(xì)胞增殖的功能，提示人類上皮性卵巢癌細(xì)胞能體外誘導(dǎo)非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。改變培養(yǎng)上清中卵巢癌細(xì)胞分泌的單一細(xì)胞因子水平，不影響人類上皮性卵巢癌細(xì)胞誘導(dǎo)激活的人類CD4+CD2