肝癌患者CD4+CD25+CD127low--CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞與肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤相關(guān)死亡率中位居第三位。我國是肝癌高發(fā)地區(qū)，約占全球肝癌病例一半以上。肝癌嚴重影響我國人民的健康事業(yè)，并帶來了巨大的社會負擔。由于肝癌早期診斷較難，患者就診時往往已屬晚期。雖然近來手術(shù)切除、肝移植、射頻消融、肝動脈栓塞化療和分子靶向治療等手段對肝癌的治療取得了很大的進步，但總體上術(shù)后高復發(fā)率和高死亡率近來未有明顯改善。免疫治療作為

2、腫瘤最有希望的治療手段越來越受到重視。同時肝臟作為免疫特惠器官又是免疫治療理想的靶器官。既往對肝癌的研究集中在肝癌細胞本身的生物學行為上，忽略了肝癌演進過程中肝癌細胞與腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment)中各種免疫細胞之間的相互作用，而后者被認為在腫瘤的發(fā)展、侵襲中發(fā)揮重要的作用。具有免疫抑制性作用的調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)在腫瘤細胞逃避局部微環(huán)境的免疫監(jiān)視從而發(fā)生免疫逃逸的過程

3、中，扮演著重要的角色。
　　 本研究從腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞的特異性表面標志入手，證實了在免疫微環(huán)境中CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞的浸潤和表達，表現(xiàn)為更強的免疫抑制表型，并與肝癌的臨床病理特征相關(guān)。進而我們通過全基因芯片篩選出較重要的調(diào)控腫瘤浸潤調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制功能相關(guān)的功能基因，分析腫瘤浸潤調(diào)節(jié)性T細胞與腫瘤細胞相互作用的免疫信號通路。基于凝集素芯片檢測HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞膜特

4、征性的聚糖改變。最后通過對調(diào)節(jié)性T細胞與galectin-1在HCC中表達的相關(guān)性分析，為HCC預后的預測和免疫治療提供新的選擇。
　　 第一部分HCC患者CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞的表達和表型研究
　　 本部分研究旨在探索CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞在HCC患者體內(nèi)不同部位(外周血、癌旁肝臟和癌灶)的分布和表達。
　　 我們通過梯度離心結(jié)合酶

5、消化法，建立了穩(wěn)定的獲取外周血、組織內(nèi)浸潤淋巴細胞分離方法。借助于流式細胞儀，首次采用四色熒光分選淋巴細胞，配對比較分析了三處不同來源的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞的分布表達和表型。發(fā)現(xiàn)在。HCC患者外周血、癌旁肝組織和癌灶中，CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞的分布和免疫表型截然不同。首先，HCC患者腫瘤微環(huán)境中存在高表達FoxP3的CD4+CD25+CD127low/-C

6、D49d-調(diào)節(jié)性T細胞。其次，HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞占整個CD4+T細胞比例顯著高于健康對照者。HCC患者腫瘤浸潤調(diào)節(jié)性T細胞占整個CD4+T細胞比例顯著高于配對的癌旁肝組織和外周血。最后，HCC患者癌灶浸潤調(diào)節(jié)性T細胞表達較高的免疫抑制表型，如FoxP3、CTLA-4和GITR?；旌狭馨图毎麑嶒烇@示CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞對活化分子CD154的抑制率較對照明顯增強，表明具有較強的免疫抑制能力

7、。結(jié)合體外擴增實驗結(jié)果，這群淋巴細胞分泌高水平的免疫抑制因子IL-10和TGF-β1，擴增后的細胞仍保持較高的抑制表型。我們分選出的腫瘤浸潤的這群具有抑制能力的淋巴細胞較癌旁肝組織和外周血來源的顯示出更強的免疫抑制能力。
　　 我們首次采用四色熒光分選出的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T淋巴細胞高表達調(diào)節(jié)性T細胞的特異性標志FoxP3，較其他相關(guān)研究文獻可獲得更高純度的調(diào)節(jié)性T細胞，并且這群高表達FoxP3的

8、T淋巴細胞保持活性狀態(tài)，可用于下游的功能實驗。CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T細胞高表達于肝癌腫瘤微環(huán)境中，表現(xiàn)出更強的免疫抑制表型，體現(xiàn)了腫瘤免疫微環(huán)境中調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制功能，參與HCC的腫瘤生物學進程。
　　 第二部分基于全基因芯片的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞基因表達譜分析
　　 結(jié)合前部分研究結(jié)果和其他相關(guān)文獻報道，我們可以認為癌灶浸潤性調(diào)節(jié)性T細胞之所

9、以表達增強的抑制表型，必然是受到腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞和其他免疫細胞的影響，導致其與免疫抑制功能相關(guān)的基因表達上調(diào)和信號通路激活。但具體參與的調(diào)控基因和信號通路尚未有系統(tǒng)的報道。在本部分研究中，我們利用Agilent全基因芯片對9例HCC患者配對的癌灶和癌旁肝組織中的調(diào)節(jié)性T細胞進行全基因表達譜的對比分析，以期找出與免疫抑制功能相關(guān)的關(guān)鍵差異基因及相應的信號通路。
　　 我們利用酶消化法和梯度離心法分離出癌灶和癌旁肝組織浸潤淋巴細

10、胞，再利用流式細胞儀分選CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞。細胞RNA抽提后與Agilent全基因芯片雜交，GenePix4000B芯片掃描儀掃描分析結(jié)果。結(jié)果顯示Hierarchical聚類分析樣本劃分不同組別明顯。將標準設為Fold Change≥2，P＜0.05后，癌灶浸潤調(diào)節(jié)性T細胞相對于癌旁肝組織浸潤調(diào)節(jié)性T細胞共有1032個基因表達上調(diào)，1357個基因表達下調(diào)。PATHWAY結(jié)果顯示兩組間有7條上

11、調(diào)通路和9條下調(diào)通路差異。GO分析顯示癌灶浸潤調(diào)節(jié)性T細胞相對于癌旁肝組織調(diào)節(jié)性T細胞有431條GO條目上調(diào)，237條GO條目下調(diào)。我們選取與腫瘤免疫和T細胞免疫相關(guān)的GO條目并按照Fold Change大小，從前15條中選取基因CD46、BCL6、TNFRSF11A、MDM4、P2RX7、CD276和IL6R進行分析，并對選取的基因進行RT-PCR驗證。
　　 其中高表達RANK(TNFRSF11A基因編碼)的調(diào)節(jié)性T細胞與高

12、表達RANKL的HCC腫瘤細胞之間的RANK-RANKL信號通路，高表達IL-6R的調(diào)節(jié)性T細胞與高表達IL-6的HCC腫瘤細胞之間的IL6-IL-6R信號通路在HCC腫瘤免疫逃逸中可能起到很重要的作用。
　　 第三部分凝集素芯片檢測CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞和肝癌細胞株HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L和Hep3B特征性糖基化改變
　　 腫瘤特征性糖基化改變影響著腫瘤細胞的

13、惡性生物學行為。同樣，異常的糖基化改變也影響著調(diào)節(jié)性T細胞的功能。目前，糖生物方興未艾，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個新的領域。腫瘤細胞異常的糖基化改變已證實與腫瘤細胞的惡性生物學行為相關(guān)。糖基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控糖基化改變?，F(xiàn)已證實糖基化改變在淋巴細胞的成熟，陰性陽性分化選擇，歸巢，凋亡等過程中起著非常重要的作用。調(diào)節(jié)性T細胞的功能也必然伴隨著糖基化的改變而改變。凝集素是一種可以與特定糖鏈結(jié)合的糖蛋白，利用此特性可以檢測出特定糖鏈的表達和改變。國內(nèi)目

14、前尚未廣泛開展基于凝集素芯片的肝癌相關(guān)研究。
　　 我們已于前期成功構(gòu)建檢測糖基化改變的凝集素芯片，并檢測出不同來源的甲胎蛋白之間細微的聚糖改變，為我們這部分的實驗奠定了基礎。本部分實驗首先在前期的基礎上擴大凝集素芯片上凝集素的種類至32種，以便能夠更準確地捕捉糖鏈的改變。我們構(gòu)建的對細胞膜表面糖鏈可進行即時、高通量檢測的凝集素芯片，優(yōu)點在于將凝集素與芯片技術(shù)相結(jié)合，利用芯片高通量、高特異性、高靈敏度等優(yōu)點，對提取的膜蛋白糖鏈進

15、行自動捕獲，成功地實現(xiàn)對細胞膜表面糖鏈進行高通量的檢測分析，獲得細胞膜表面糖鏈全面而綜合的信息。甘露糖抑制實驗和胎球蛋白實驗充分顯示我們構(gòu)建的凝集素芯片具有糖鏈結(jié)合的特異性、準確性和穩(wěn)定性。最后我們將分選的HCC患者與健康志愿者的外周血CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞提取細胞膜蛋白后與芯片雜交后發(fā)現(xiàn)HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞較健康對照的外周血調(diào)節(jié)性T細胞膜表面α1-6巖藻糖、α1-6甘露糖、GalNac、

16、β型半乳糖鏈、復雜型N-聚糖增加。另外，我們選取轉(zhuǎn)移潛能梯度降低的人肝癌細胞株HCCLM3、MHCC97H、MHCC97L和幾乎不轉(zhuǎn)移的Hep3B，經(jīng)細胞膜蛋白提取和Trizol提取RNA后，分別與凝集素芯片和糖基轉(zhuǎn)移酶PCR芯片雜交。結(jié)果提示，HCCLM3相對于Hep3B，代表唾液酸糖鏈的MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA明顯增加；代表甘露糖鏈的ConA和GNA明顯增加；代表巖藻糖鏈的LTL、LCA、PSA和UEA-1明顯增加；代表半乳糖

17、鏈的BPL、EEL、jacalin，GSL-1增加；代表GlcNAc的PHA-L增加；代表GalNAc的VVA、DBA、SBA明顯增加。糖基轉(zhuǎn)移酶PCR芯片結(jié)果提示HCCLM3較Hep3B，ST3Gal1、FUT8和MGAT5等轉(zhuǎn)移酶增高。其中MAL-Ⅰ，MAL-Ⅱ和WGA變化相對于ST3Gal1，PSA、LCA相對于FUT8，PHA-L相對于MGAT5。
　　 因此我們可以認為調(diào)節(jié)性T細胞特征性糖基化改變可能伴隨著免疫功能的變

18、化。HCC細胞的特征性糖基化改變及相應的糖基轉(zhuǎn)移酶改變?yōu)槟[瘤的治療從糖生物學的角度提供了新的方向。
　　 第四部分Galectin-1對HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移的影響及與調(diào)節(jié)性T細胞相關(guān)性的研究
　　 異常的糖基化改變影響著腫瘤的惡性生物學行為。Galectin-1是半乳凝素家族重要成員之一，通過與腫瘤細胞表面聚糖(glycan)形成galectin-glycan結(jié)構(gòu)參與調(diào)控腫瘤的分化、遷移、凋亡和信號轉(zhuǎn)導等生物學過程。在許多腫瘤

19、中都發(fā)現(xiàn)galectin-1表達的增高與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。許多高表達galectin-1的腫瘤都提示不良預后。近來研究表明調(diào)節(jié)性T細胞參與介導腫瘤細胞免疫逃逸的過程中受到腫瘤細胞來源的galectin-1的信號調(diào)控。同時，我們前面的實驗結(jié)果也顯示HCC患者外周血Treg膜表面表達較高的半乳糖鏈。目前在HCC中尚未有關(guān)galectin-1和Treg的表達及相關(guān)性的報道。
　　 在本部分研究中我們通過免疫組化的方法，對包含3

20、86例HCC患者的組織芯片檢測FoxP3+Treg和galectin-1的表達，并通過生存分析觀察galectin-1與預后的關(guān)系。同時通過流式細胞儀和ELISA分別檢測31例HCC患者的外周血中的CD4+CD25+FoxP3+Treg和galectin-1的表達，以期發(fā)現(xiàn)兩者在組織和外周血之間的相關(guān)性。最后我們利用ELISA法驗證了147例HCC患者血清中g(shù)alectin-1的表達水平。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)galectin-1在HCC腫瘤組織

21、中高表達，是獨立的預后指標。高表達galectin-1的HCC患者預后較差。Galectin-1與HCC的臨床病理特征相關(guān)，如腫瘤大小、包膜是否完整和血管侵犯等等。在BCLC早期的HCC患者中，galectin-1也顯示出預測預后的價值。肝癌組織中Galectin-1的表達與FoxP3+Treg數(shù)量兩者呈正相關(guān)，但是在外周血中兩者的表達無相關(guān)性。
　　 我們的結(jié)果提示腫瘤微環(huán)境中的galectin-1可能促進Treg在HCC中擴

22、增，進而影響腫瘤的發(fā)展和預后，為腫瘤的免疫治療提供了新的靶點。
　　 結(jié)論
　　 1.CD4+CD25+CD127low/-CD49d-T淋巴細胞高表達調(diào)節(jié)性T細胞的特異性標志FoxP3。
　　 2.腫瘤浸潤性調(diào)節(jié)性T細胞可能通過IL6R/IL6、RANK/RANKL信號通路參與HCC腫瘤細胞的免疫逃逸。
　　 3.HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞較健康對照的外周血調(diào)節(jié)性T細胞膜表面α1-6巖藻糖、α1-6甘

23、露糖、GalNac、β型半乳糖鏈、復雜型N-聚糖增加。調(diào)節(jié)性T細胞特征性糖基化的改變可能伴隨著細胞免疫抑制功能的變化。
　　 4.肝癌細胞具有α2-3，α2-6唾液酸、巖藻糖、平分型GlcNAc等糖鏈表達上調(diào)，可能受糖基轉(zhuǎn)移酶ST6GALNAC1、ST3Gal1、FUT8和MGAT5等調(diào)控。
　　 5.Galectin-1在HCC中的高表達伴隨著調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量的增加，聯(lián)合調(diào)節(jié)性T細胞和galectin-1可增加預測HC

24、C患者預后的準確性?？勺鳛镠CC免疫治療的靶點。
　　 創(chuàng)新點
　　 1.首次在HCC患者中分選出具有活性的可供功能實驗所需的CD4+CD25+CD127low/-CD49d-調(diào)節(jié)性T細胞。
　　 2.首次提出IL6R/IL6、RANK/RANKL信號通路可能參與HCC腫瘤浸潤性調(diào)節(jié)性T細胞介導的腫瘤免疫逃逸。
　　 3.HCC患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞特征性糖基化的改變可能伴隨著細胞免疫抑制功能的變化。