lncRNA NEAT1調(diào)控宿主抗?jié)h灘病毒固有免疫應(yīng)答分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景：
　　漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）屬于布尼亞病毒目（Bunyavirales）漢坦病毒科（Hantaviridae），是我國(guó)重癥腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）的主要病原體。HFRS死亡率為0.1％-15%，迄今尚無(wú)針對(duì)HTNV感染的特異性藥物。以干擾素（interferon,IFN）為核心的固有免疫應(yīng)答在機(jī)體抵御HTNV感染的過(guò)程中發(fā)

2、揮重要作用，而RIG-I作為宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體（pathogen recognition receptor,PRR）能夠識(shí)別病毒的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IFN。目前尚不清楚HTNV感染后宿主細(xì)胞中RIG-I信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。近期研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）可調(diào)控PRR等多種固有免疫相關(guān)

3、基因的表達(dá)，與病毒感染增殖及其所致疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道HTNV感染后宿主lncRNA表達(dá)變化及其作用。
　　目的：
　　本研究旨在通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜（digital gene expression,DGE）分析HTNV-宿主細(xì)胞相互作用過(guò)程中宿主lncRNA的表達(dá)變化，從中篩選出具有抗病毒作用的分子并明確其抗HTNV感染的分子機(jī)制，為抗HTNV藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法與結(jié)果：
　　1.

4、NEAT1正向調(diào)控I型IFN信號(hào)通路活化進(jìn)而抑制HTNV感染的作用確定
　　1.1 NEAT1在HTNV感染后表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)與感染時(shí)間及感染劑量相關(guān)
　　為研究HTNV感染后宿主細(xì)胞lncRNA表達(dá)變化，將HTNV以MOI=1感染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs），同時(shí)設(shè)置Mock組（純細(xì)胞組）、Co60-HTNV組（Co60滅活病毒處理組）

5、，24hpi提取RNA進(jìn)行DGE分析，結(jié)果表明與Mock組或Co60-HTNV組相比，HTNV組中NEAT1、GAS5、IPW等多種lncRNA分子表達(dá)變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中l(wèi)ncRNA NEAT1表達(dá)上調(diào)顯著。熒光原位雜交（FISH）和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）等實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HTNV感染可在HUVECs、HEK293、A549、HeLa等多種細(xì)胞系中誘導(dǎo)NEAT1表達(dá)上調(diào)，且NEAT1表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)與感染時(shí)間、感染劑量在一定范圍

6、內(nèi)呈正相關(guān)。
　　1.2 體外干預(yù)NEAT1-2表達(dá)可影響宿主細(xì)胞IFN產(chǎn)生及HTNV復(fù)制
　　為明確 NEAT1在漢坦病毒感染過(guò)程中的作用，在HUVECs中分別轉(zhuǎn)染敲減NEAT1的siRNA或過(guò)表達(dá)NEAT1的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24h后以MOI=0.1或1感染HTNV，48hpi進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR、Western Blot及in-cell western等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲減NEAT1-2可促進(jìn)HTNVS片段復(fù)制及HTNV

7、 NP表達(dá)，而過(guò)表達(dá)NEAT1-2可抑制HTNV感染。qRT-PCR及ELISA等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲減NEAT1-2可抑制HTNV感染后宿主細(xì)胞IFNβ、IL-8、CCL5的產(chǎn)生，而過(guò)表達(dá)NEAT1-2則促進(jìn)HTNV感染后宿主細(xì)胞IFNβ、IL-8、CCL5的產(chǎn)生。NEAT1-2敲減條件下使用IFNβ處理細(xì)胞可抑制HTNV感染，而NEAT1-2過(guò)表達(dá)條件下使用IFNβ中和抗體可抑制HTNV感染。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NEAT1-2可通過(guò)正向調(diào)控

8、宿主細(xì)胞IFNβ產(chǎn)生進(jìn)而抑制HTNV復(fù)制。
　　1.3 體內(nèi)敲減NEAT1-2可在HTNV感染早期抑制機(jī)體IFN產(chǎn)生并加重HTNV感染
　　為進(jìn)一步研究NEAT1-2在體內(nèi)對(duì) HTNV感染的影響，通過(guò)尾靜脈注射siRNA的方式在C57BL/6J小鼠體內(nèi)敲減NEAT1-2分子，之后感染HTNV，于3dpi進(jìn)行ELISA、qRT-PCR、HE染色、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（FCM）等實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與NC+HTNV組相比，Si-NEAT1-

9、2+HTNV組小鼠外周血IFNβ水平降低，肝、脾、腎等臟器中HTNVS片段及NP表達(dá)升高、病毒滴度增加，各臟器炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少但病理?yè)p傷加重，其中脾臟中CD11b+F4/80+Mφ、及CD8+IFNγ+T細(xì)胞數(shù)目減少。
　　2.NEAT1-2與RIG-I信號(hào)通路交互作用調(diào)控I型IFN信號(hào)通路的分子機(jī)制研究
　　2.1 HTNV感染通過(guò)RIG-I-IRF7信號(hào)通路誘導(dǎo)NEAT1-2表達(dá)上調(diào)
　　上述實(shí)驗(yàn)利用細(xì)胞及動(dòng)物感染

10、模型明確了NEAT1-2抗HTNV感染的作用，但尚不清楚HTNV誘導(dǎo)NEAT1上調(diào)的分子機(jī)制。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HUVECs中過(guò)表達(dá)HTNV NP/Gn/Gc，或使用IFNα/β/γ、IL-1β、TNFα等不同細(xì)胞因子刺激HUVECs均不能誘導(dǎo)NEAT1-2上調(diào)；在HUVECs中敲減TLR3/4或MDA5亦不能阻遏HTNV感染后NEAT1-2表達(dá)，而在HUVECs中敲減RIG-I或IRF7，或在RIG-I敲除的細(xì)胞系Huh7

11、.5中，HTNV感染不能誘導(dǎo)NEAT1-2表達(dá)，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HTNV主要通過(guò)RIG-I-IRF7信號(hào)通路誘導(dǎo)宿主細(xì)胞NEAT1-2表達(dá)。
　　2.2 NEAT1-2正向調(diào)控HTNV感染后RIG-I及DDX60表達(dá)間接促進(jìn)IFNβ表達(dá)
　　為了明確NEAT1調(diào)控IFNβ表達(dá)的作用機(jī)制，在HUVECs中敲減NEAT1-2后感染HTNV，qRT-PCR及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NEAT1-2敲減后宿主細(xì)胞的RIG-

12、I及DDX60分子顯著下調(diào)。為明確RIG-I及DDX60分子在HTNV感染中的作用，在HUVECs中單獨(dú)敲減RIG-I或DDX60，或共同敲減兩者后感染HTNV，qRT-PCR、Western Blot等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與NC對(duì)照組或單獨(dú)敲減組相比，共同敲減組IFNβ產(chǎn)生減少，HTNV復(fù)制增加；在HUVECs中單獨(dú)過(guò)表達(dá)RIG-I或DDX60，或共同過(guò)表達(dá)兩者后感染HTNV，qRT-PCR、Western Blot等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明與Vecto

13、r對(duì)照組或單獨(dú)過(guò)表達(dá)組相比，共同過(guò)表達(dá)組IFNβ產(chǎn)生增加，HTNV復(fù)制減少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HTNV感染誘導(dǎo)NEAT1上調(diào)，NEAT1可促進(jìn)RIG-I及DDX60表達(dá)，兩者協(xié)同調(diào)控HTNV感染后宿主細(xì)胞IFNβ產(chǎn)生，抑制HTNV感染增殖。
　　2.3 NEAT1-2通過(guò)募集SFPQ調(diào)控RIG-I及DDX60表達(dá)間接發(fā)揮抗HTNV作用
　　既往生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果表明脯氨酸及谷氨酰胺富集剪接因子（the splicing fact

14、or proline-glutamine rich,SFPQ）可能結(jié)合與RIG-I及DDX60啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)而抑制其轉(zhuǎn)錄，而NEAT1-2結(jié)合 SFPQ解除其轉(zhuǎn)錄抑制作用。為研究NEAT1-2調(diào)控RIG-I及DDX60表達(dá)的分子機(jī)制，通過(guò)RNA免疫共沉淀技術(shù)（RIP）檢測(cè)HTNV感染前后NEAT1-2與蛋白SFPQ的結(jié)合變化，結(jié)果提示HTNV感染后NEAT1與SFPQ結(jié)合增加。通過(guò)Western Blot、免疫熒光技術(shù)（IFA）分別檢測(cè)S

15、FPQ在HTNV感染前后的蛋白表達(dá)量及亞細(xì)胞定位變化，結(jié)果表明SFPQ在HTNV感染前后表達(dá)量并無(wú)變化，而在感染前其彌散分布于核內(nèi)，感染后在核內(nèi)形成斑點(diǎn)。通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）檢測(cè)SFPQ與核旁斑形成蛋白NONO在HTNV感染前后的結(jié)合情況，結(jié)果顯示HTNV感染后SFPQ和NONO結(jié)合增加，上述結(jié)果提示HTNV感染后核旁斑形成增加。通過(guò)qRT-PCR等技術(shù)檢測(cè)SFPQ敲減條件下HUVECs中RIG-I、DDX60分子表達(dá)變化及

16、HTNV病毒復(fù)制情況，結(jié)果表明敲減SFPQ可促進(jìn)RIG-I及DDX60表達(dá)，抑制HTNV感染后S片段復(fù)制。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示HTNV感染后NEAT1-2可募集SFPQ形成核旁斑，解除其對(duì)RIG-I及DDX60的轉(zhuǎn)錄抑制作用，間接發(fā)揮抗HTNV感染的功能。
　　3.HFRS患者外周血單核細(xì)胞中NEAT1-2表達(dá)水平與疾病進(jìn)展的相關(guān)性研究
　　為明確NEAT1-2與HFRS疾病進(jìn)展的關(guān)系，本研究利用陰性選擇法分離HFRS患者外周血

17、中的單核細(xì)胞（monocytes，Mo），通過(guò)qRT-PCR檢測(cè) NEAT1-2的表達(dá)水平，分析其與疾病病程及病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，結(jié)果表明與健康人或 HFRS恢復(fù)期患者相比，HFRS發(fā)熱期、低血壓休克期及少尿期患者外周血Mo中的NEAT1-2水平明顯升高。將外周血Mo中NEAT1-2表達(dá)水平與患者血清病毒載量、血肌酐（Scr）最高值、血小板數(shù)目（PLT）最低值及血白細(xì)胞數(shù)（WBC）進(jìn)行回歸分析，結(jié)果提示NEAT1-2表達(dá)水平與外周血病毒