白芍對小鼠的抗炎鎮(zhèn)痛效果及固有免疫分子機制研究.pdf

1、炎癥(Inflammation)為機體受到有害刺激時所產(chǎn)生的一種抗損傷的防御性病理反應(yīng)，其臨床特征為局部的紅(Redness)、腫(Swelling)、熱(Heat)、痛(Pain)和機體功能障礙(Loss of function)，其發(fā)熱、紅腫、疼痛等臨床癥候與中醫(yī)的“熱”證型所伴有的高熱、汗出、舌紅苔黃、肌膚生瘡發(fā)熱等癥候相似。中醫(yī)學理論認為“熱”和“火”是炎癥的主要病因病機，機體感受熱邪、或外感寒邪化熱、或內(nèi)有郁積化熱而致“熱”證

2、，臨床多見高熱、煩渴、汗出等癥。根據(jù)“熱”的證型以及不同發(fā)展階段，中醫(yī)對“熱”證的治則有清熱瀉火、滋陰清熱、清泄里熱、清上溫下等。
　　白芍是常用中藥，有白芍、赤芍之分，二者各具不同的功效?！夺t(yī)學啟源》中記載白芍功能主治包括“安脾經(jīng)、治腹痛、瀉肝”，古方中也不乏有以白芍為君藥的方劑，如白芍散，黃蓮白芍湯等。在現(xiàn)代醫(yī)學文獻中關(guān)于白芍的抗炎免疫活性及作用機制的研究報道甚少，而炎癥和免疫在組織、細胞、分子水平上是緊密聯(lián)系不可分割的過程，

3、因此，本研究擬采用急性炎癥模型和疼痛反應(yīng)模型，觀察白芍(以下簡稱Pae)的抗炎鎮(zhèn)痛活性，并從病理組織學、免疫學及分子生物學等角度初步探討其部分固有免疫分子機制，以期明確白芍抗炎免疫藥理活性的作用機理，為中藥白芍的進一步研發(fā)和有效運用提供理論依據(jù)。其試驗主要結(jié)果及結(jié)論如下:
　　1.白芍的抗炎鎮(zhèn)痛活性研究
　　試驗采用二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致毛細血管通透性改變試驗和醋酸致小鼠扭體反應(yīng)試驗研究白芍的抗炎鎮(zhèn)痛效果。結(jié)果表明:白芍

4、的三個劑量(10g/kg、5g/kg和2.5g/kg)均能不同程度抑制小鼠耳腫脹，其高劑量(10g/kg)、中劑量(5g/kg)組的小鼠耳腫脹率分別為22.39％(P＜0.05)、28.90％(P＜0.01)，顯著或極顯著降低二甲苯致小鼠的耳腫脹。白芍高、中、低劑量的腹腔毛細血管通透性增加抑制率分別為25.12％、41.87％、4.43％，其白芍的中劑量(5g/kg)組的腹腔毛細血管通透性增加抑制率顯著高于陰性對照組(P＜0.05)。白

5、芍的三個劑量均能降低醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，以中劑量(5g/kg)的效果最佳，扭體反應(yīng)次數(shù)抑制率為43.88％，與陰性對照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果提示:白芍可減輕炎癥、舒緩疼痛，具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛活性。
　　2.小鼠膿毒癥模型的建立及白芍對小鼠膿毒癥的干預(yù)效果
　　通過腹腔注射LPS建立小鼠膿毒癥模型，進行白芍干預(yù)小鼠膿毒癥的試驗研究。觀察LPS膿毒癥模型復(fù)制后2h～72h小鼠的臨床癥候，表現(xiàn)為:LPS攻毒后小鼠出現(xiàn)

6、食欲下降，行動緩慢、倦怠、嗜睡、被毛蓬松等癥狀，剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)皮下、腸系膜充血或出血，部分肝組織可見白色點狀壞死;組織學觀察可見LPS模型組在攻毒后前期和后期小鼠肝細胞界限不清或消失，肝竇淤血，炎性細胞浸潤，肝細胞變性，部分呈彌漫性壞死;染毒后12h～36h病理變化最明顯，表現(xiàn)為中央靜脈擴張充血，靜脈壁細胞脫落，甚至出現(xiàn)細胞凋亡壞死。經(jīng)白芍干預(yù)治療后，小鼠的臨床癥狀及剖檢癥狀較LPS模型組有所減輕，肝組織結(jié)構(gòu)有不同程度的損傷，肝小葉結(jié)構(gòu)較

7、清晰，見少量出血，肝細胞排列較紊亂，部分出現(xiàn)變性壞死，可見未完全溶解的核碎屑;48h少數(shù)肝細胞炎性浸潤伴有輕度水腫，胞漿疏松化，中央靜脈少許擴張，周圍有少量的肝細胞壞死及炎性浸潤;72h肝組織結(jié)構(gòu)清晰，有少量的炎性細胞浸潤，肝細胞較完整;白芍干預(yù)治療組小鼠死亡數(shù)較LPS膿毒癥組少，且其組織病理變化與地塞米松干預(yù)組小鼠相近。表明白芍可減輕LPS膿毒癥小鼠的臨床癥候、病理損傷及減少小鼠死亡數(shù)，對小鼠膿毒癥具有保護作用。
　　3.白芍對

8、LPS膿毒癥小鼠肝組織中TLR4及下游相關(guān)信號分子mRNA表達量的影響
　　分子同有免疫學研究發(fā)現(xiàn)，TLR4能夠識別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞內(nèi)，激活MyD88、NF-κB等基因的轉(zhuǎn)錄，進而發(fā)揮固有免疫作用，因此，分析信號通路中重要因子表達量的變化可以初步判定藥物的作用靶位。本試驗分析TLR4/MyD88/NF-κB信號通路中幾個重要節(jié)點分子表達量的變化，初步確定白芍發(fā)揮抗炎作用的固有免疫機制及其可能作用靶標。

9、試驗采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，LPS模型組小鼠的TLR4、MyD88、NF-κB等目的基因mRNA表達水平在12h～36h均不同程度升高，其相對表達量分別12h、36h、24h達到峰值，顯著或極顯著高于陰性對照組(P＜0.05或P＜0.01)。而經(jīng)白芍干預(yù)處理的小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB總體

10、水平均低于未給予藥物干預(yù)的LPS模型組，分別在12h(7.15±0.23 vs9.44±1.12)、36h(4.44±0.98 vs13.06±1.7)、24h(3.29±0.43 vs7.34±2.06)極顯著低于LPS模型組;TNF-α、IL-1β的mRNA表達水平亦顯著降低(2.37±0.61 vs7.34±2.06)、(14.92±2.07 vs15.52±1.12); IL-4的表達水平均高于LPS模型組小鼠，分別在6h、24

11、h～72h與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，IL-10 mRNA表達水平均略低于LPS模型組小鼠，36h其表達水平與模型組比較差異極顯著(P＜0.01)，但其余時間點與LPS模型組的差異均不顯著。研究結(jié)果表明:TLR4可識別LPS，并激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，提高促炎因子相關(guān)基因TNF-α、IL-1β mRNA表達的表達水平，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生;白芍可通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，抑制LPS受體TLR

12、4及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MyD88、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、促炎細胞因子TNF-a、IL-1β及促進抗炎細胞因子IL-4、IL-10的mRNA水平的表達，達到抑制炎癥反應(yīng)效果。提示TLR4/MyD88/NF-κB信號通路中MyD88、NF-κB等各節(jié)點重要分子可能是白芍發(fā)揮抗炎作用的靶標。
　　4.白芍對LPS膿毒癥小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1含量的影響
　　TNF-α、IL-1β是機體重要的致炎因

13、子，其合成和分泌能夠激活炎癥反應(yīng)。IL-4、IL-10是重要的抗炎因子及免疫抑制劑，二者可強烈抑制免疫細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等炎癥介質(zhì)，抑制單核-巨噬細胞內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)位至細胞核。同時，HMGB1作為一種晚期炎癥介質(zhì)，是膿毒癥的重要調(diào)節(jié)因子。中藥機制之一為影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進而調(diào)節(jié)細胞因子的合成和釋放米發(fā)揮其抗炎作用?；诖耍驹囼炌ㄟ^建立小鼠LPS膿毒癥模型，以及用白芍干預(yù)后2h～72h小鼠外周血中TNF-α、IL-1β、IL-4、

14、IL-10及HMGB1含量的檢測，評價白芍對小鼠LPS膿毒癥的抗炎效果。試驗采用雙抗體夾心ELISA方法，建立小鼠血清中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10及HMGB1標準曲線，線性相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，表明所建立的標準曲線可用于計算待檢樣品的含量。小鼠經(jīng)LPS處理后，各時間點血清中致炎細胞因子TNF-α、IL-1β、HMGB1含量均高于陰性對照組，分別在6h、12h、36h達到最大值。而經(jīng)過白芍處理后，TNF-α

15、、IL-1β、HMGB1含量峰值的分別為達到328.63±16.49pg/ml、176.38±11.70pg/ml和97.73±11.85ng/ml，較LPS模型組有顯著下降(P＜0.01或P＜0.05);IL-4水平在36h(128.76±24.68ng/ml)、48h(95.71±57.09pg/ml)顯著高于膿毒癥模型組(P＜0.05)，而IL-10的含量顯著高于同時間點陰性對照組，在36h～48h顯著低于LPS模型組，但與LPS