Rhbdd3分子在免疫應(yīng)答調(diào)控中的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分Rhbdd3分子抑制TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化及其機制研究
　　 天然免疫應(yīng)答在機體抵抗病原體侵襲過程中發(fā)揮重要作用。NK細胞是一種重要的天然免疫細胞，通過釋放多種細胞因子及殺傷性物質(zhì)介導(dǎo)免疫活化和免疫監(jiān)視，在機體抵抗感染和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。隨著近年來對天然免疫應(yīng)答中模式識別機制的認識不斷深入，發(fā)現(xiàn)NK細胞也表達多種TLR，尤其是與T細胞、B細胞、單核細胞相比表達更高水平的TLR3。已證實，當(dāng)TLR3與其配體。

2、poly(I：C)相互作用后能以直接或間接的方式誘導(dǎo)NK細胞活化。大量研究表明NK細胞功能紊亂參與了多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病的病理過程。TLR3觸發(fā)的NK細胞活化在肝臟炎癥與損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，NK細胞活化受到免疫系統(tǒng)的精密調(diào)控，然而目前關(guān)于NK細胞功能負向調(diào)控機制的研究卻并不深入。機體在生理情況下如何控制NK細胞不被過度活化以維持免疫穩(wěn)態(tài)、避免免疫病理損傷的發(fā)生?是否存在新型的調(diào)控蛋白參與控制TLR3或其他信號介導(dǎo)的NK細

3、胞活化?這些新型調(diào)控蛋白通過何種分子機制影響NK細胞活化，是否需要其他免疫細胞或免疫分子的參與?對這些科學(xué)問題的回答不但有助于深入了解NK細胞如何受到嚴格調(diào)節(jié)以維持生理條件下的免疫穩(wěn)態(tài)，而且為NK細胞過度活化引發(fā)的相關(guān)疾病的控制提供潛在的藥物靶點。
　　 Rhbdd3分子屬于一類含有Rhomboid結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，早期被稱為垂體瘤凋亡基因(pituitary tumor apoptosis gene，PTAG)。本人在碩士課題

4、研究中發(fā)現(xiàn)Rhbdd3分子能夠通過控制DC成熟及抑制TLR觸發(fā)的NF-κB信號通路活化，抑制IL-6等炎癥因子的釋放，維持體內(nèi)Treg與Th1和Th17的平衡，進而在整體水平上抑制自身免疫性疾病的發(fā)生。本課題中，我們研究了Rhbdd3分子是否在TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化過程中也具有調(diào)控作用，并進一步研究了其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制及其對NK細胞介導(dǎo)的TLR3觸發(fā)的急性肝損傷的抑制作用。
　　 1.Rhbdd3分子負向調(diào)節(jié)TLR3觸發(fā)的NK細

5、胞活化
　　 首先，我們從體內(nèi)外2個方面，研究Rhbdd3分子是否對NK細胞活化具有調(diào)控作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)，Rhbdd3-/-小鼠來源的脾臟細胞在poly(I：C)刺激后比野生型對照組分泌更高水平的IFN-γ和IL-6，而在IL-12和IL-15刺激后分泌的IFN-γ和IL-6水平與對照組相似；進一步發(fā)現(xiàn)，在poly(I：C)刺激后Rhbdd3-/-小鼠脾臟細胞中NK1.1+細胞表達的胞內(nèi)granzymeB、perforin及I

6、FN-γ水平比野生型對照組明顯增高，而IL-12和IL-15刺激后的表達水平與對照組相似，提示Rhbdd3分子能特異性調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化。在體內(nèi)實驗中，分別給予Rhbdd3-/-和野生型小鼠體內(nèi)poly(I：C)處理后，發(fā)現(xiàn)Rhbdd3-/-小鼠肝臟中的NK細胞募集比野生型小鼠明顯增多，且肝臟NK1.1+NK細胞的胞內(nèi)granzymeB、perforin及IFN-γ表達水平及對NK細胞殺傷作用敏感的YAC-1腫瘤細胞的殺傷活

7、性均比野生型明顯增強。綜合上述體內(nèi)外研究結(jié)果，表明Rhbdd3分子能夠負向調(diào)控TLR3觸發(fā)的脾臟及肝臟中NK細胞的活化，并抑制NK細胞在病理情況下在肝臟的募集。
　　 2.Rhbdd3分子負向調(diào)控TLR3觸發(fā)的NK細胞活化的機制
　　 (1)Rhbdd3分子抑制TLR3激活NK細胞依賴于NK細胞與其他細胞的相互接觸
　　 為了探討Rhbdd3分子負向調(diào)控TLR3觸發(fā)的NK細胞活化的機制，我們首先分離了DX5+脾臟

8、NK細胞，發(fā)現(xiàn)在DX5+NK細胞單獨存在的情況下，無論Rhbdd3-/-小鼠還是野生型小鼠來源的DX5+NK細胞在poly(I：C)刺激后都分泌相似低水平的IFN-γ，而無論有無poly(I：C)刺激，Rhbdd3-/-小鼠NK細胞殺傷活性均比野生型明顯增強。考慮到在沒有其他支持因素存在的情況下，單純NK細胞在體外培養(yǎng)條件下極易凋亡，我們在培養(yǎng)體系中加入IL-12和IL-15來支持NK細胞的生存。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在IL-12和IL-15支持下，

9、小鼠DX5+NK細胞在poly(I：C)后分泌極高水平的IFN-γ；但是比較Rhbdd3-/-小鼠與野生型小鼠來源的DX5+NK細胞，無論poly(I：C)刺激與否，都分泌同等高水平的IFN-γ。以上結(jié)果表明，在IL-12和IL-15存在的情況下，單獨存在的NK細胞在TLR3配體刺激后能夠發(fā)生明顯的活化，但Rhbdd3分子不能夠直接調(diào)控TLR3誘導(dǎo)的NK細胞活化，需要其他因素的存在。
　　 由于脾臟包含多種細胞類型，于是我們推測

10、是否其他細胞參與了Rhbdd3分子對TLR3觸發(fā)NK細胞活化的調(diào)控作用。首先，我們通過transwell共培養(yǎng)體系阻斷脾臟細胞中DX5+NK細胞與余下的DX5-細胞的相互接觸，發(fā)現(xiàn)在poly(I：C)誘導(dǎo)下脾臟細胞分泌的IFN-γ及NK1.1+細胞上表達granzymeB的水平與未分隔的體系相比均明顯下降，表明在NK與其他細胞相互接觸的情況下，TLR3配體才能夠最佳地誘導(dǎo)NK活化。且在這種Transwell分隔體系下，TLR3配體刺激后

11、，Rhbdd3-/-和野生型小鼠脾細胞分泌的IFN-γ及NK1.1+細胞上表達granzymeB的水平?jīng)]有明顯差異。因此，Rhbdd3分子負向調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化依賴于NK細胞與其他細胞的相互接觸。
　　 (2)Rhbdd3分子抑制TLR3激活NK細胞依賴于NK細胞與DC或Kupffer細胞的相互接觸
　　 已有文獻報道，NK細胞與DC能以細胞間相互接觸依賴的方式相互調(diào)節(jié)。我們的前期研究已經(jīng)證實Rhbdd3分子

12、能夠負向調(diào)控TLR觸發(fā)的樹突狀細胞活化，于是我們推測DC等抗原提呈細胞可能是Rhbdd3分子負向調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化過程中所依賴的細胞類型。此外，由于TLR3信號的過度活化是誘導(dǎo)肝臟炎癥與損傷的一種致病機制，因此我們選取了2種抗原提呈細胞，骨髓來源DC和肝臟Kupffer巨噬細胞(KC)，研究是否這些細胞的存在參與了Rhbdd3分子負向調(diào)控TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化。
　　 我們將Rhbdd3-/-小鼠或野生型小鼠來源

13、的NK細胞分別與這兩種小鼠的骨髓來源DC或肝臟KC以不同組合共同培養(yǎng)，包括：WTNK+WTDC(或KC)；WTNK+Rhbdd3-/-DC(或KC)；Rhbdd3-/-NK+WTDC(或KC)；Rhbdd3-/-NK+Rhbdd3-/-DC(或KC)，并同時給予poly(I：C)刺激。我們發(fā)現(xiàn)在與同一種基因型的DC或Kupffer細胞相互作用下，poly(I：C)能夠刺激Rhbdd3-/-小鼠來源的NK細胞分泌比野生型NK細胞更高水平的

14、IFN-γ，其中Rhbdd3-/-NK1.1+細胞胞內(nèi)ⅡFN-γ和granzymeB表達水平也顯著高于野生型NK細胞。此外，Rhbdd3-/-DC比野生型DC更有效促進poly(I：C)誘導(dǎo)的同一種NK細胞的活化，進一步證實了以前的研究中Rhbdd3對TLR3觸發(fā)的DC成熟的負向調(diào)控作用。以上結(jié)果表明，DC及Kupffer細胞參與了Rhbdd3分子對TLR3觸發(fā)的NK細胞活化的負向調(diào)控作用。
　　 (3)Rhbdd3分子通過抑制

15、DAP12表達而抑制TLR3觸發(fā)的NK細胞活化
　　 我們接下來深入研究了Rhbdd3分子負向調(diào)節(jié)TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化的分子機制。首先我們檢測了Rhbdd3分子在TLR3刺激NK細胞前后的表達，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)給予poly(I：C)處理或者體外用poly(I：C)刺激全脾細胞后，脾臟中NK細胞表達Rhbdd3分子的水平明顯增高，而在IL-12/15刺激下NK細胞表達Rhbdd3分子沒有變化，表明TLR3信號能夠上調(diào)NK細胞表達R

16、hbdd3分子。
　　 除了TLR信號能夠活化NK細胞，NK細胞的活化還取決于其細胞表面的NK細胞活化型受體和抑制型受體介導(dǎo)信號的強弱，因此我們檢測了是否Rhbdd3分子參與調(diào)節(jié)NK細胞表面這些受體的表達水平，然而結(jié)果顯示NK細胞表達這些受體不受Rhbdd3分子影響。
　　 DAP12蛋白是與NK細胞活化受體相連的一種adaptor蛋白，對傳遞活化信號至關(guān)重要。雖然NK細胞表達活化受體不受Rhbdd3分子影響，但我們發(fā)現(xiàn)

17、用干擾RNA阻斷野生型NK細胞中Rhbdd3分子的表達后，DAP12在蛋白水平明顯增強而在mRNA水平?jīng)]有明顯的差異，提示Rhbdd3分子可能在翻譯或翻譯后水平調(diào)控DAP12的表達。通過confocal顯微鏡，我們觀察到NK細胞中Rhbdd3分子在poly(I：C)刺激后與DAP12相互靠近而產(chǎn)生共定位。這些結(jié)果提示TLR3活化后，Rhbdd3分子能與DAP12相互作用并負向調(diào)控DAP12表達，從而實現(xiàn)負向調(diào)控NK細胞活化。
　　

18、 我們進一步研究了在poly(I：C)刺激下，Rhbdd3-/-來源NK細胞在與DC共培養(yǎng)后胞內(nèi)MAPK信號的活化情況，發(fā)現(xiàn)p-ERK、p-JNK及p-p38水平與野生型NK細胞相比明顯增高。同樣，體內(nèi)實驗結(jié)果表明，給予poly(I：C)刺激后，Rhbdd3-/-來源小鼠的脾臟NK細胞p-ERK、p-JNK及p-p38活化水平比對照組明顯增高，而NF-κB通路無明顯差異。
　　 綜上表明，NK細胞在體內(nèi)受到TLR3信號刺激后上

19、調(diào)Rhbdd3分子的表達，而Rhbdd3分子通過抑制DAP12的表達并控制下游MAPK的活化反饋性抑制TLR3介導(dǎo)的NK細胞活化。
　　 3.Rhbdd3分子通過控制NK細胞活化而抑制TLR3誘導(dǎo)的急性肝損傷
　　 鑒于NK細胞是TLR3誘導(dǎo)急性肝損傷的主要效應(yīng)細胞，在上述研究基礎(chǔ)上，我們從整體角度進一步研究了Rhbdd3分子是否在TLR3觸發(fā)的肝損傷中具有保護作用。我們發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)給予poly(I：C)刺激后，Rhbdd

20、3-/-小鼠血清中ALT、AST、IFN-γ及IL-6水平比野生型對照組明顯增高，肝臟病理顯示肝臟中炎性細胞浸潤及肝組織壞死也比對照組明顯增強，提示Rhbdd3分子能有效保護TLR3觸發(fā)的急性肝損傷。進一步，我們發(fā)現(xiàn)，用抗NK1.1單克隆抗體清除體內(nèi)NK細胞可有效保護Rhbdd3-/-及野生型小鼠在poly(I：C)注射后發(fā)生的急性肝損傷；在此基礎(chǔ)上，過繼回輸NK細胞后可恢復(fù)NK細胞清除的小鼠對poly(I：C)誘導(dǎo)急性肝損傷的敏感性，

21、而回輸Rhbdd3-/-NK細胞比回輸野生型NK細胞能導(dǎo)致NK細胞清除小鼠在poly(I：C)注射后發(fā)生更為嚴重的肝臟損傷。上述結(jié)果證實Rhbdd3分子通過控制NK細胞活化從而減弱TLR3觸發(fā)的急性肝損傷的發(fā)生。
　　 綜上，通過本課題的研究我們得出如下結(jié)論：TLR3活化劑進入機體后誘導(dǎo)NK細胞活化并上調(diào)Rhbdd3分子的表達。在NK細胞與其他細胞相互作用的過程中，Rhbdd3分子通過下調(diào)NK細胞中DAP12表達而抑制NK細胞在

22、與其他細胞相互作用中獲得的活化信號，并抑制其下游MAPK通路活化；另一方面，Rhbdd3分子還能抑制。NK細胞向肝臟的募集及NK細胞與肝臟Kupffer細胞的相互作用，最終達到控制TLR3觸發(fā)的急性肝臟損傷的作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)了Rhbdd3對NK細胞活化的負向調(diào)控功能并闡明了其分子機制，揭示了機體在天然免疫應(yīng)答過程中如何實現(xiàn)免疫自穩(wěn)的新型調(diào)控機制，為NK細胞相關(guān)的急性炎癥損傷的控制提供了可能的靶點。
　　 第二部分Rhbdd3

23、分子負向調(diào)控TLR誘導(dǎo)樹突狀細胞活化的機制研究
　　 樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)是機體功能最強大的專職抗原提呈細胞，通過模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體表達的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，在炎癥反應(yīng)、天然免疫應(yīng)答以及后續(xù)激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。樹突狀細胞活

24、化的調(diào)控機制的研究對于感染、腫瘤及自身免疫性疾病等疾病的治療策略研究以及疫苗的設(shè)計研發(fā)都具有重要意義。作為研究最為廣泛的一類PRRs，TLRs表達于DC等天然免疫細胞，其介導(dǎo)的信號通路能夠誘導(dǎo)DC成熟和活化。其中TLR4可以通過Myd88依賴和非依賴方式最終激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB；在Myd88依賴途徑中，TLR4通過招募Myd88而活化IRAK1和IRAK4激酶，進而招募并結(jié)合TRAF6，促進TRAF6和NEMO發(fā)生K63多聚泛素化。K

25、63多聚泛素鏈的形成激活下游TAK1復(fù)合體，并激活I(lǐng)KK復(fù)合體進而促進IκB磷酸化并與NF-κB解離，釋放NF-κB入核，誘導(dǎo)炎性細胞因子產(chǎn)生。對于TLR如何激活下游信號通路促進NF-κB活化已有較清楚認識，然而對于TLR介導(dǎo)的NF-κB活化過程是如何受到調(diào)控的研究并不深入。
　　 蛋白質(zhì)分子的泛素化是調(diào)控細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個重要分子機制。在誘導(dǎo)NF-κB活化的信號通路中，NEMO分子通過泛素連接(NEMO-ubiquitin

26、binding，NUB)結(jié)構(gòu)域連接K63多聚泛素鏈，與TAB2/3共同促進NF-κB活化。雖然NEMO泛素化在TLR信號活化中發(fā)揮的關(guān)鍵作用得到深入研究，然而其具體分子機制，特別是NEMO泛素化如何受到調(diào)節(jié)以及NEMO泛素位點與泛素鏈的相互關(guān)系尚不十分清楚。對于機體如何調(diào)控TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化，特別是NEMO泛素化對NF-κB活化的調(diào)節(jié)作用的具體分子機制的研究將有助于深入認識天然免疫應(yīng)答的活化與調(diào)控機制，為免疫相關(guān)疾病的預(yù)防與控

27、制提供了新的研究思路。
　　 本人在碩士課題研究中發(fā)現(xiàn)Rhbdd3分子通過其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO相互作用抑制TLR4誘導(dǎo)的NF-κB活化，抑制TLR觸發(fā)的DC成熟和炎性因子的產(chǎn)生，進而控制Th17及Treg分化的平衡及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。本課題中我們深入研究了Rhbdd3分子如何影響TLR4誘導(dǎo)NF-κB活化的分子機制。
　　 1.Rhbdd3分子通過UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO蛋白K302位點連接的K27位多聚泛素鏈

28、相互作用，進而抑制NF-κB活化
　　 本人在碩士期間的研究表明，Rhbdd3-/-小鼠來源BMDC在LPS刺激后與野生型BMDC相比NF-κB活化明顯增強，而過表達Rhbdd3能顯著抑制TNF-α或LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活化。通過轉(zhuǎn)染突變的Rhbdd3分子和免疫共沉淀實驗，我們證實Rhbdd3分子通過其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO分子發(fā)生相互作用。
　　 在本課題中，我們進一步對NEMO中與Rhbdd3分子相互作用的關(guān)鍵性

29、位點進行了尋找。我們對NEMO中可能發(fā)生泛素化的保守位點進行了突變，構(gòu)建了一系列攜帶不同突變位點的NEMO表達質(zhì)粒。通過將突變的Rhbdd3分子和NEMO分子共轉(zhuǎn)染細胞及免疫共沉淀實驗，我們發(fā)現(xiàn)，K302位點是NEMO蛋白上與Rhbdd3分子相互作用的關(guān)鍵位點。
　　 雖然很多證據(jù)表明泛素分子中K48的多聚泛素化鏈的形成主要介導(dǎo)發(fā)生泛素化信號分子的降解作用，而K63位的多聚泛素鏈主要介導(dǎo)信號分子的定位和活化作用，泛素中其他位點發(fā)

30、生的多聚泛素鏈對信號分子的作用目前罕有報道。我們對泛素分子中的不同賴氨酸位點分別進行了點突變，構(gòu)建了一系列攜帶突變泛素分子基因的表達質(zhì)粒，每個質(zhì)粒中只保留了1個正常Lys位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變泛素中K27位點的質(zhì)?？赏耆齊hbdd3分子與NEMO蛋白的相互作用。
　　 可見，Rhbdd3分子依賴其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMO蛋白K302位點連接的K27多聚泛素鏈相互作用，進而抑制TLR4誘導(dǎo)的NF-κB活化。
　　 2.Rhb

31、dd3分子促進A20介導(dǎo)的NEMOK278/K392位點發(fā)生K63位去泛素化，進而抑制TLR誘導(dǎo)的NF-κB活化
　　 (1)Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K278和K392位點發(fā)生K63多聚泛素化
　　 接下來，我們進一步研究了Rhbdd3分子與NEMO相互作用后如何調(diào)控NF-κB活化。NEMO蛋白的K63位多聚泛素化是TLR誘導(dǎo)IKK復(fù)合體活化的關(guān)鍵步驟。我們發(fā)現(xiàn)，Rhbdd3-/-BMDC的K63泛素化水平明顯高

32、于對照組DC，且過表達Rhbdd3分子能抑制NEMO的K63多聚泛素化，表明Rhbdd3分子參與控制NEMO的K63多聚泛素化；此外，NEMO分子上K278和K392位點突變可顯著抑制NEMO蛋白結(jié)合K63泛素鏈，表明NEMO的K63多聚泛素鏈主要結(jié)合在NEMO的K278和K392位點。因此，Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K278位和K392位發(fā)生K63的多聚泛素化。
　　 (2)Rhbdd3分子招募并與A20結(jié)合從而促進A2

33、0與NEMO的相互作用
　　 上述研究表明Rhbdd3分子抑制NEMO蛋白K63多聚泛素化。已有文獻報道A20通過去泛素化NEMO上連接的K63位多聚泛素鏈抑制TLR誘導(dǎo)的NF-κB活化。于是我們進一步研究是否A20在Rhbdd3分子負向調(diào)控NEMO的K63泛素化中發(fā)揮作用。我們通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)Rhbdd3-/-DC在LPS誘導(dǎo)后Rhbdd3分子和A20的結(jié)合比對照組顯著減弱；過表達全長Rhbdd3能同時結(jié)合NEMO和A2

34、0,并促進A20與NEMO的相互結(jié)合；缺失189-321序列的Rhbdd3突變體則不具有此效應(yīng)。綜上表明，Rhbdd3分子通過其189-321位未知保守序列招募并與A20相互作用，促進A20與NEMO的結(jié)合，從而促進A20對NEMO的K63位多聚泛素鏈的降解作用，實現(xiàn)控制NF-κB活化。
　　 綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了Rhbdd3分子控制TLR誘導(dǎo)NF-κB活化的分子機制，即Rhbdd3通過其UBA結(jié)構(gòu)域與NEMOK302位點的K27

35、多聚泛素鏈相互作用，并通過其189-321位未知保守序列招募A20并與A20分子相互作用，促進A20介導(dǎo)的NEMO蛋白K278/K392位點連接的K63位泛素鏈去泛素化，進而抑制NF-κB活化。本課題首次揭示了Rhbdd3負向調(diào)控TLR/NEMO/NF-κB信號通路的分子機制，豐富了對蛋白泛素化調(diào)控的分子機制的認識。我們對Rhbdd3的免疫學(xué)功能與作用機制的研究不但有助于解釋與NF-κB過度活化相關(guān)的炎癥性疾病的發(fā)生機制，也有可能成為一