HBV感染引起的肝細(xì)胞microRNA表達(dá)譜變化及其靶標(biāo)分析.pdf

1、乙肝病毒(hepatitisBvirus，HBV)，是一種小的雙鏈DNA病毒，是目前已知的感染人類最小的雙鏈DNA病毒，屬于屬于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。HBV感染肝細(xì)胞后，能引起一系列的疾病，如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等，還往往伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥。 首先，我們利用Exiqon公司的miRNAmicroarray芯片(8.0)，以HepG2.2.15為實驗組，以HepG2細(xì)胞為對照，分析二者miRN

2、A表達(dá)譜系的差異，找出表達(dá)水平顯著改變(上調(diào)或下調(diào)超過2倍)的miRNA。HepG2.2.15細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV基因后的細(xì)胞，HBV基因己穩(wěn)定整合，能分泌各種病毒蛋白和病毒顆粒，是研究HBV感染的一個理想的體外模型。Exiqon公司的miRNAmicroarray芯片能檢測到miRBase數(shù)據(jù)庫(8.0版)中所有已注冊的人的miRNA分子；而且該芯片基于鎖核酸(LockedNucleicAcids，LNA)技術(shù)構(gòu)

3、建，使芯片雜交時具有較高而一致的雜交溫度，可以較靈敏、特異性地檢測差異表達(dá)的miRNA。利用該芯片對HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)有9個miRNA的表達(dá)發(fā)生顯著變化。其中上調(diào)的有3個，分別為hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345；下調(diào)的miRNA共有6個，分別為：hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-1et-7a、hsa-1et-7c、hsa

4、-1et-7f和hsa-miR-23b。 為了進(jìn)一步驗證上述芯片結(jié)果的可靠性，我們采用TaqmanmiR-qRT-PCR試劑盒(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,America)對HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中上述9種miRNA分子表達(dá)情況進(jìn)行分析。U6是一種在各種細(xì)胞中表達(dá)較為穩(wěn)定的RNA，在本實驗中作為內(nèi)對照使用。所得數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法進(jìn)行分析。最終分析結(jié)果與芯片結(jié)果相符，即顯著下調(diào)的為

5、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b；而顯著上調(diào)的miRNA為hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345，說明芯片結(jié)果是可靠的。 然后，我們進(jìn)一步驗證上述miRNA表達(dá)發(fā)生改變，是HBV引起的一種特異性變化，還是一般病毒感染后引起的一種非特異性變化。我們首先建立了4種非HBV感染的HepG2細(xì)胞，

6、并進(jìn)行了鑒定。這4種病毒分別為貓免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiencyvirus，F(xiàn)IV)、鼠干細(xì)胞病毒(MurineStemCellVires，MSCV)、登革病毒(Denguevirus，DV)、單純皰疹病毒(herpessimplexvires，HSV)，其中前3種為RNA病毒，后一種為DNA病毒。然后，利用TaqmanRT-PCR試劑盒檢測這些病毒感染細(xì)胞株(即HepG2-FIV、HepG2-MSCV、Hep

7、G2-DV、HepG2-HSV)中hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-1et-7a、hsa-1et-7c、hsa-let-7f、hsa-miR-23b、hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345的表達(dá)情況。結(jié)果表明在這些非HBV感染的HepG2細(xì)胞中，上述miRNA的表達(dá)未發(fā)生顯著性改變，提示，HepG2.2.15細(xì)胞中上述miRNA表達(dá)發(fā)生顯著改變是HBV特異性的。 由于H

8、epG2.2.15是通過將含有HBV全基因組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞建立的穩(wěn)定克隆，是模擬HBV感染，與真正的HBV感染細(xì)胞有一定的差異。而PLC/PRF/5是從-HBV感染者體內(nèi)分離得到，是自然整合有HBV的一株肝癌細(xì)胞株，是研究HBV感染的另外常用的體外模型。因此，我們進(jìn)一步檢測了上述miRNA在該細(xì)胞中的表達(dá)情況。實驗結(jié)果表明：hsa-miR-194和hsa-miR-200a顯著性上調(diào)；hsa-let-7a、hsa-let-7c和

9、hsa-1et-7f下調(diào)表達(dá)，而hsa-miR-24、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-23b和hsa-miR-345的表達(dá)水平則沒有發(fā)生顯著性變化。提示hsa-miR-194、hsa-miR-200a、hsa-let-7a、hsa-let-7c和hsa-let-7f表達(dá)發(fā)生改變可能與HBV感染相關(guān)。 但無論分析miRNA在HepG2.2.15細(xì)胞的表達(dá)情況、在非HBV感染細(xì)胞株中的表達(dá)情況，還是在PLC/PRF/5

10、細(xì)胞的表達(dá)情況，只是為我們提供了一種離體狀態(tài)下的情況。真正的體內(nèi)過程往往與體外過程有不小的差異，因此我們進(jìn)一步檢測了miRNA在慢性乙肝患者肝臟標(biāo)本中的表達(dá)情況，揭示miRNA在體內(nèi)的表達(dá)狀態(tài)。利用定量PCR方法檢測了12個慢性乙肝患者的穿刺標(biāo)本miRNA表達(dá)情況，以3例肝移植手術(shù)中健康供體肝臟組織作為正常對照。結(jié)果表明：hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-23b、hsa-miR-194表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生

11、顯著性改變；hsa-miR-24、hsa-let-7c和hsa-mir-200a在某些標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)，而在另外一些標(biāo)本中則表達(dá)上調(diào)；只有hsa-let-7a和hsa-let-7f在12例標(biāo)本中均顯著性下調(diào)。綜上所述，hsa-let-7a和hsa-let-7f最可能是HBV感染后肝臟細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平發(fā)生顯著改變的miRNA。那么，是否HBV通過下調(diào)hsa-let-7a和hsa-let-7f，改變肝臟細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，使之更有利于HBV的感染過程?

12、 既往研究表明，miRNA可能通過以下幾種機(jī)制參與病毒感染的致病過程：宿主的miRNA作用于病毒基因，調(diào)控病毒基因的表達(dá)；病毒基因組編碼病毒來源的miRNA，調(diào)控病毒基因的表達(dá)；病毒基因組來源的miRNA作用宿主基因，調(diào)控宿主基因的表達(dá)。因此，HBV感染后肝細(xì)胞內(nèi)變化的miRNA，即hsa-let-7a和hsa-let-7f是否也可以作用于HBV基因，并調(diào)控這些基因編碼蛋白的表達(dá)? ViTa是由HsuPW等建立的一個軟件

13、(http://vita.mbc.nctu.edu.tw/)，可以較好地預(yù)測人的miRNA在病毒基因中靶標(biāo)。我們借助于該軟件預(yù)測了hsa-let-7a和hsa-let-7f在HBV基因組中的靶標(biāo)。預(yù)測結(jié)果表明：hsa-let-7a在HBV基因組中有一個潛在的靶標(biāo)，3105-3135處位于Presl和多聚酶(P蛋白)的共同編碼區(qū)(3105-3135處)，該區(qū)域在乙肝的生命周期中具有重要作用；沒有發(fā)現(xiàn)HBV基因組中有hsa-let-7f的作

14、用位點。 為了驗證該潛在位點是否為hsa-let-7a的作用位點，我們將該序列導(dǎo)入pMIR-REPORT熒光素酶表達(dá)載體，構(gòu)建報告系統(tǒng)；同時，將let-7a表達(dá)質(zhì)粒PH1-RNA-let-7a導(dǎo)入293T細(xì)胞，通過抗生素篩選后得到單克隆，qRT-PCR鑒定后，我們得到2株穩(wěn)定表達(dá)let-7a的細(xì)胞株，293-7a-1和293-7a-2。將含有靶序列的pMIR-report導(dǎo)入293-7a-1和293-7a-2后，進(jìn)行熒光素酶實驗

15、，結(jié)果提示，hsa-let-7a可以作用該位點，降低熒光素酶的表達(dá)。為進(jìn)一步驗證，我們將let-7a表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入HepG2.2.15細(xì)胞株，上調(diào)hsa-let-7a的表達(dá)，檢測HBV拷貝數(shù)及上清中Presl蛋白水平變化情況。實驗結(jié)果表明，hsa-let-7a上調(diào)后：HBVDNA拷貝數(shù)顯著降低，上清中presl蛋白水平也明顯下降，進(jìn)一步證實了HBV基因組中hsa-let-7a作用位點的存在。 綜上所述，在本實驗中，我們借助于mic

16、roRNA芯片技術(shù)，以HepG2.2.15細(xì)胞作為HBV的體外感染模型以HepG2細(xì)胞作為對照，分析表達(dá)顯著改變的miRNA；然后利用定量PCR.對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證后，進(jìn)一步檢測了這些miRNA在一系列的細(xì)胞株及慢性乙肝患者肝穿標(biāo)本中的表達(dá)情況，結(jié)果提示HBV感染引起肝細(xì)胞內(nèi)hsa-let-7a和hsa-let-7f顯著下調(diào)。然后，我們進(jìn)一步分析了hsa-let-7a和hsa-let-7f的靶標(biāo)，利用ViTa軟件預(yù)測二者在HBV基因組的