PRV感染Neuro-2a細(xì)胞中microRNA表達(dá)譜的測(cè)定.pdf

1、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)是α皰疹病毒亞科的重要成員之一，具有神經(jīng)嗜性和潛伏感染性，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。病毒感染宿主后miRNA在皰疹病毒的生活史及病原宿主互作中起到非常重要的調(diào)控作用。目前關(guān)于PRV體外的研究大多使用PK-15細(xì)胞，而在神經(jīng)細(xì)胞上的研究很少見(jiàn)到。本研究旨在建立PRV感染小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞(Neuro-2a)的細(xì)胞感染模型并測(cè)定miRNA表達(dá)譜，并對(duì)病原與宿主互作的可能機(jī)制進(jìn)行探討

2、。
　　用PRV感染Neuro-2a細(xì)胞后，通過(guò)細(xì)胞病變觀察、TCID50測(cè)定、PCR及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了PRV在Neuro-2a內(nèi)的增殖情況。結(jié)果顯示，PRV感染后，Neuro-2a產(chǎn)生典型的細(xì)胞病變;經(jīng)TCID50測(cè)定發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，病毒滴度逐漸增高;PCR及間接免疫熒光試驗(yàn)顯示PRV可在Neuro-2a上增殖。表明該P(yáng)RV可適應(yīng)Neuro-2a細(xì)胞，它可用于研究PRV感染、潛伏感染以及致病機(jī)制。
　　建立檢測(cè)

3、PRV IE180、EP0、VP16表達(dá)水平的熒光定量方法(qRT-PCR)，并用于檢測(cè)PRV分別感染PK-15細(xì)胞及Neuro-2a細(xì)胞(MOI=5)后0h、2h、4h、6h， IE180、EP0、VP16的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，在兩種不同的細(xì)胞內(nèi)PRV IE180、EP0、VP16的表達(dá)趨勢(shì)存在差異，提示PRV感染上皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞時(shí)采用的“策略”存在差異。
　　用Solexa測(cè)序技術(shù)及stem-loop qRT-PCR鑒定P

4、RV感染Neuro-2a細(xì)胞后miRNA表達(dá)譜。利用生物信息學(xué)方法，分析宿主及PRV miRNA針對(duì)病毒靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖以及病毒感染對(duì)宿主miRNA表達(dá)譜的影響。高通量的結(jié)果顯示，4h實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到PRV編碼的miRNA共7種，分別為prv-miR-LLT1、prv-miR-LLT2、prv-miR-LLT4、prv-miR-LLT5、prv-miR-LLT6、prv-miR-LLT10a、prv-miR-LLT10b。這些miRNA

5、的表達(dá)量都很低。28h實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到PRV編碼的miRNA共10種，比4h實(shí)驗(yàn)組多出3種，分別為prv-miR-LLT3、prv-miR-LLT11a、prv-miR-LLT11b。28h實(shí)驗(yàn)組中PRV編碼的miRNA表達(dá)量均上調(diào)。miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的PRV編碼的13種miRNA，prv-miR-LLT7、prv-miR-LLT8、prv-miR-LLT9在4h和28h實(shí)驗(yàn)組中均未表達(dá)。通過(guò)比較可知PRV感染Neuro-2a細(xì)胞

6、后，有4種宿主miRNA（miR-146b-5p、miR-714、miR-466k、miR-6538）在感染后4h上調(diào)表達(dá)。感染后28h時(shí)，7種miRNA(miR-301a-3p、miR-1249-3p、miR-6538、miR-714、miR-19a-3p、miR-101c、miR-99b-5p)差異表達(dá)，其中只有miR-99b-5p下調(diào)表達(dá)，其余上調(diào)表達(dá)。相對(duì)于4h實(shí)驗(yàn)組，在28h實(shí)驗(yàn)組中PRV編碼的miRNA，僅有prv-miR-

7、LLT1的表達(dá)量顯著上調(diào)。用stem-loopqRT-PCR方法驗(yàn)證了高通量測(cè)序結(jié)果的可靠性。差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析結(jié)果表明，宿主miRNA調(diào)控的基因主要影響細(xì)胞組分、分子功能及生物學(xué)過(guò)程;Pathway分析結(jié)果顯示宿主miRNA調(diào)控的基因主要參與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(Akt)信號(hào)通路、促分裂素原活化蛋白激酶信號(hào)通路、神經(jīng)信號(hào)傳遞通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路、焦點(diǎn)粘連。用差異表達(dá)的宿主及病毒m