Nitrofen誘導(dǎo)的CDH大鼠中microRNA表達(dá)譜及miR-33表達(dá)的意義.pdf

1、目的
　　1.探討nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝（congenital diaphragmatic hernia，CDH）大鼠模型與正常大鼠胎肺中微小RNA（microRNA)表達(dá)譜的差異；
　　2.尋找與nitrofen誘導(dǎo)的CDH大鼠肺發(fā)育不良相關(guān)的miRNAs并用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)其靶基因。
　　方法
　　1.建立nitrofen誘導(dǎo)的CDH大鼠動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組
　　取SPF（無特定病原體）級(jí)成年

2、SD雌性大鼠12只，將其一一編號(hào)，并用隨機(jī)數(shù)字表分為對(duì)照組和nitrofen誘導(dǎo)組，另取6只雄性SD大鼠，將雌性與雄性大鼠按2比1合籠過夜，于第二日上午在顯微鏡下觀察雌性大鼠陰道涂片，有大量精子者視為妊娠，當(dāng)天上午則定為妊娠第0.5天。nitrofen誘導(dǎo)組大鼠于妊娠第9.5天，經(jīng)胃管注入1 ml nitrofen橄欖油溶液（即將nitrofen溶于橄欖油中，濃度100 mg/ml），對(duì)照組大鼠注入1 ml未經(jīng)處理的橄欖油。兩組分別于妊

3、娠第21.5天在麻醉狀態(tài)下行剖宮產(chǎn)取出胎鼠，解剖胎鼠胸腔后取左肺進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　2.取部分胎肺標(biāo)本進(jìn)行HE染色處理，觀察對(duì)照組和nitrofen誘導(dǎo)組胎肺的發(fā)育情況。
　　3.利用miRNA芯片檢測(cè)nitrofen誘導(dǎo)組及對(duì)照組大鼠胎肺miRNAs表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；
　　4.挑選miRNA芯片結(jié)果中nitrofen誘導(dǎo)組顯著下調(diào)的miR-33作為驗(yàn)證對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證；
　

4、　用TriZol法提取大鼠胎肺總RNA，并檢測(cè)總RNA濃度，用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)各標(biāo)本中miR-33和內(nèi)參U6的表達(dá)量，然后分別經(jīng)過校正后得出各個(gè)胎肺標(biāo)本中 miR-33的相對(duì)表達(dá)量。
　　5.運(yùn)用生物信息學(xué)軟件MiRDB、TargetScan、MICRORNA.ORG預(yù)測(cè)miR-33可能調(diào)控的靶基因。
　　結(jié)果
　　1.建立nitrofen誘導(dǎo)的CDH

5、大鼠模型
　　將孕21.5天孕鼠全身麻醉后剖開子宮取出胎鼠，對(duì)照組的6只孕鼠得到胎鼠50只；nitrofen誘導(dǎo)組得到胎鼠51只，總的膈疝數(shù)32只，其中左側(cè)膈疝25只，占49%，并觀察到誘導(dǎo)組胎鼠膈疝中主要為左側(cè)膈疝，還包括少量右側(cè)和雙側(cè)膈疝，疝入的器官主要為肝臟和胃，少部分為小腸和脾臟。解剖膈疝胎鼠胸腔后可見雙側(cè)肺體積均縮小，與對(duì)照組相比左側(cè)減小程度更大。
　　2.組織學(xué)檢查
　　對(duì)照組胎鼠左側(cè)胎肺發(fā)育較成熟，與其相

6、比，nitrofen誘導(dǎo)組胎鼠左側(cè)肺發(fā)育明顯滯后，支氣管分支明顯減少，大部分肺泡塌陷，肺泡管、肺泡囊呈假腺樣體改變，肺泡間隔彌漫性增寬，小動(dòng)脈肌層增厚，平滑肌增生。
　　3.miRNA表達(dá)譜差異分析
　　通過對(duì)CDH組和對(duì)照組大鼠胎肺中miRNA表達(dá)譜的差異分析，CDH組中有11個(gè)miRNA上調(diào)，分別是miR-3588、miR-382*、miR-363、miR-375、miR-487b、miR-483、miR-382、miR

7、-495、miR-434、miR-181a、miR-99a，有14個(gè)下調(diào)如 miR-33、miR-193、miR-338、miR-30c-2*、miR-22、miR-18a、miR-532-5p、miR-28、miR-96、miR-551b、miR-141、miR-362*、miR-30a*、miR-3559-5p。
　　4.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　用qRT-PCR檢測(cè)miR-33在nitrofen誘導(dǎo)的先天性膈疝大鼠胎

8、肺中的表達(dá)，nitrofen誘導(dǎo)組中miR-33的表達(dá)量約為正常組的0.64倍(P<0.05)，與芯片結(jié)果一致。
　　5.靶基因預(yù)測(cè)
　　運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)miR-33進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)果篩選出10個(gè)可能的靶基因，包括ABC1、ST18、PDGFRA、PRKAA1、B3GALT2、KRAS、C17orf39、NAA15、HIPK1、HMGA2。
　　結(jié)論：
　　miR-33在Nitrofen誘導(dǎo)的CDH組中表達(dá)