瘦素在人骨關(guān)節(jié)炎中的作用.pdf

1、一研究背景 骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一組原因不明的關(guān)節(jié)退行性疾病，其主要病理特征為關(guān)節(jié)軟骨的破壞和骨贅形成。OA在世界各地廣泛分布，無明顯種族和地域差異，且發(fā)病率高，在63-70歲的人群中，出現(xiàn)影像學(xué)上膝關(guān)節(jié)OA的比例約為27％；而在80歲以上人群中，可增加至44％。OA已經(jīng)成為我們所面臨的嚴(yán)峻問題。 首先引起研究者關(guān)注的是肥胖的生物力學(xué)作用對OA的影響，當(dāng)一個(gè)人在行走的過程中，通過膝關(guān)節(jié)的重量大

2、約為體重的3-6倍，因此，肥胖者的體重不僅加重了承重關(guān)節(jié)的負(fù)荷，也增加了OA的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)節(jié)負(fù)荷在OA發(fā)病過程中起到了一定的作用，然而，這卻難以解釋非承重關(guān)節(jié)(如手關(guān)節(jié))的OA表現(xiàn)。Dumond等首次在OA患者的關(guān)節(jié)液中發(fā)現(xiàn)了瘦素(Lp，leptin)，且瘦素水平與體重指數(shù)密切相關(guān)，這意味著瘦素等代謝因素可能在OA的發(fā)病中起重要作用。 瘦素主要是由脂肪細(xì)胞分泌的循環(huán)激素，由ob基因編碼的一種分泌型蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)體重、神經(jīng)內(nèi)分泌

3、、生育、免疫炎癥反應(yīng)與血管生成等。此外，瘦素在炎癥反應(yīng)中具有雙重作用，一方面，它激活單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生TNF—α、IL等炎性細(xì)胞因子，誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，表達(dá)干擾素；另一方面，它能夠刺激IL-1受體拮抗劑等抗炎因子的釋放。 為了了解瘦素在OA中的作用及可能機(jī)制，本研究進(jìn)一步比較我國健康人群及OA患者的血清、滑液瘦素水平與西方國家的差異，觀察瘦素在軟骨細(xì)胞增殖和分泌功能中的作用，以期為闡明瘦素在國人OA中的發(fā)病機(jī)

4、制提供新的思路，為治療OA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二目的 觀測瘦素在中國健康人群及OA患者血清、關(guān)節(jié)液中的分布情況與西方國家是否有差異性，觀察瘦素對軟骨細(xì)胞的增殖及分泌功能的影響，初步推測瘦素可能與OA軟骨退變及骨贅形成相關(guān)。 三方法 1、選擇了60例原發(fā)性膝關(guān)節(jié)OA患者作為實(shí)驗(yàn)組，27例健康人作為對照組。受試者禁食>8h小時(shí)，清晨空腹抽取肘靜脈血4ml，置于非抗凝試管內(nèi)，37℃水浴40min，3000rmp·m

5、in-1離心10min，留上清；另外，嚴(yán)格無菌操作，抽取膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液2-5ml，置于肝素鋰抗凝試管內(nèi)，以3000rmp·min-1離心30min(4℃)，留上清；將上清分裝于無菌EP管中，封口，置于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。采用ELISA法(enzyme linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附法)測定瘦素、TNF-α的水平，按ELISA試劑盒說明書操作。 2、取正常人及OA患者的軟骨、骨贅、

6、滑膜標(biāo)本，以10％福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡觀察其病理改變，同時(shí)作瘦素、瘦素受體的免疫組織化學(xué)染色，觀察它們在軟骨組織中的表達(dá)水平。 3、取正常人及OA患者軟骨標(biāo)本，分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，傳代并鑒定，然后加入0，10，50，100，500，1000 ng·mL-1不同濃度的瘦素進(jìn)行培養(yǎng)，通過MTT法測定第1、3、5天的軟骨細(xì)胞的增殖情況；并運(yùn)用RT—PCR方法檢測不同濃度的瘦素對軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原、TNF-α、TG

7、F-β1 mRNA表達(dá)水平的影響。 4、所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，連續(xù)性正態(tài)分布的資料以(x±s)表示，兩組均數(shù)間比較采用T Test，多組均數(shù)間比較采用One—Way Anova，兩組均數(shù)相關(guān)性分析采用簡單線性相關(guān)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四結(jié)果 1、OA患者的血清瘦素水平高于正常人群，且OA患者關(guān)節(jié)液瘦素水平明顯高于其血清(P<0.05)；此外，輕、中、重度三組OA患者的關(guān)節(jié)

8、液瘦素水平有明顯的差異性，重度組明顯高于輕、中度組；而輕、重度組OA患者的關(guān)節(jié)液TNF—α水平明顯高于中度組(P<0.05)；瘦素水平與TNF—α水平無相關(guān)性。 2、正常人及OA患者軟骨的瘦素、瘦素受體免疫組織化學(xué)染色陽性，軟骨陷窩處著色明顯，呈棕黃色顆粒，軟骨基質(zhì)無著色，對照組染色陰性。 3、正常成人軟骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，數(shù)量較多，活性良好，細(xì)胞以梭形和三角形為多，細(xì)胞可傳5代而無明顯退變跡象；而OA患者軟骨體外分離培

9、養(yǎng)的細(xì)胞與正常人相比，數(shù)量較少，活性較差，增殖較慢，形態(tài)與正常軟骨細(xì)胞相似。培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過甲苯胺藍(lán)、番紅O及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色鑒定為軟骨細(xì)胞。 4、低劑量的瘦素能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，以50ng·mL-1的濃度尤為明顯；而高劑量的瘦素則抑制軟骨細(xì)胞的增殖，以1000 ng·mL-1的濃度為明顯；且低濃度的瘦素可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型前膠原、TGF—β1 mRNA合成，高濃度抑制，呈劑量依賴性；而不同濃度的瘦素均能增加軟骨細(xì)胞TNF—