消痰和胃方對胃癌前病變大鼠胃黏膜細胞凋亡的機制研究.pdf

1、胃癌前病變(PLGC)是一類易發(fā)生癌變的胃黏膜病理學變化，在其基礎上發(fā)生的胃黏膜細胞異型增生是胃癌發(fā)生的重要組織學基礎。在國內(nèi)胃癌發(fā)病率及死亡率的趨勢逐年升高。目前根據(jù)病因而采取的一級預防目前難以實現(xiàn)，因此對胃癌前病變的防治則成為胃癌二級預防的重點。胃癌前病變的治療國際上尚無統(tǒng)一規(guī)范及推薦藥物；中藥在本病的治療上取得了一定的成績，越來越受到國內(nèi)外學者重視。魏品康教授總結四十余年臨床經(jīng)驗，認為“痰濁內(nèi)蘊”與胃癌前病變的產(chǎn)生密切相關，在此理

2、論基礎上，自創(chuàng)消痰和胃方（原名消痰養(yǎng)胃方）用于治療胃癌前病變，臨床結果表明該方能改善臨床癥狀，逆轉病理狀態(tài)，但機制尚不明確。而現(xiàn)代研究證實胃癌前病變的發(fā)生主要是胃黏膜細胞凋亡紊亂所致，并且NF-κB通路與細胞凋亡密切相關。因此消痰和胃方是否通過調(diào)控NF-κB通路，影響PLGC胃黏膜細胞凋亡，最終逆轉PLGC是本次實驗重點探討的問題。
　　目的：
　　以化學致癌物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）誘導為主的多因素造

3、模法建立胃癌前病變大鼠模型，HE染色觀察消痰和胃方對胃癌前病變大鼠胃黏膜組織病理學的影響；TUNNEL法檢測消痰和胃方對胃癌前病變大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)的影響；采用免疫組織化學等技術檢測消痰和胃方對胃癌前病變大鼠胃黏膜細胞Bax、BCl-2及Caspase-3蛋白表達的影響；western blot檢測消痰和胃方通過改變胃癌前病變大鼠胃黏膜組織NF-κB通路相關蛋白的影響，從而干預下游凋亡相關因子的表達，進一步促進胃癌前病變胃黏膜細胞凋

4、亡，最終逆轉胃癌前病變。
　　方法：
　　第一部分：70只雄性Wistar大鼠，6周齡，隨機分為空白組及模型組。正常對照組15只，模型組55只。采用MNNG為主的多因素造模法建立胃癌前病變大鼠模型。每3天1次給予300μg/mL的MNNG灌胃，同時3天1次給予無水乙醇1ml灌胃，2天給予飲食1天禁食，每周三上午9AM夾尾使大鼠保持爭奪激怒10min。總共32周。造模過程中死亡5只。32周后模型組隨機取8只大鼠、空白組隨機取1

5、只大鼠的胃大彎處胃黏膜組織固定，石蠟包埋切片，HE染色，病理確認造模成功。
　　第二部分：將造模成功的雄性Wistar大鼠隨機分為模型對照組、維酶素組、消痰和胃組。消痰和胃方藥物組成：全方由制半夏15g、黃連9g、炒枳殼15g、桂枝9g、細辛6g、白芍15g、炙甘草6g等藥物。消痰和胃組、維酶素組、模型對照組及正常對照組分別以6g/mL的中藥水煎膏、維酶素混懸濁液、生理鹽水（后兩組）灌胃，持續(xù)6周。并每周相同時間記錄大鼠體重變化情

6、況。6周結束后，將胃大彎處胃黏膜組織固定,石蠟包埋切片,HE染色，觀察組織病理學改變情況。
　　第三部分：雄性Wistar大鼠分組給藥同第二部分。6周后，麻醉處死大鼠，將胃大彎處胃黏膜組織固定，石蠟包埋切片。免疫組化法檢測胃癌前病變大鼠胃黏膜細胞中Bax、BCl-2及Caspase-3蛋白的表達。
　　第四部分：雄性Wistar大鼠分組給藥同第二部分。6周后，麻醉處死大鼠，將胃大彎處胃黏膜組織固定，石蠟包埋切片。TUNNEL

7、法檢測胃癌前病變大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)（PI）。
　　第五部分：雄性Wistar大鼠分組給藥同第二部分。6周后，麻醉處死大鼠，迅速將胃大彎處胃黏膜組織-80℃凍存。Western blot法檢測胃黏膜組織中NF-κB P65,p-NF-κB P65蛋白表達。
　　結果：
　　1、造模32周，兩組大鼠體重相比較差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05），其中模型組體重增長趨勢緩慢。造模階段兩組體重增長值比較差異也有統(tǒng)計學意義（p<

8、0.05）。光鏡觀察可見模型組胃黏膜不完整，萎縮，細胞形態(tài)不一致，表面可見脫落的上皮細胞，有的甚至有變性、壞死，腺體排列紊亂，部分細胞腺體有囊狀擴張樣的改變。細胞核染色加深，有的可見核分裂像，表明細胞出現(xiàn)不同程度的異型變化，部分還伴有腸上皮化生。
　　2、6周療程結束后，一般情況消痰和胃組與維酶素組均好于模型對照組，其中消痰和胃組較為明顯。消痰和胃組與正常對照組治療過程中無死亡；模型對照組死亡3只（21.43％），維酶素組死亡1只

9、（7.14%）；從第4周開始，消痰和胃組與維酶素組及模型對照組體重值比較差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；維酶素組與模型對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組異型增生數(shù)相比，消痰和胃組與模型組及維酶素組比較差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05），維酶素組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　3、免疫組化檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達：消痰和胃組、維酶素組、模型對照組之間兩兩比較差異具有

10、統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　4、TUNEL法檢測細胞凋亡指數(shù)：模型對照組與正常對照組相比AI值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);消痰和胃組和維酶素組、模型對照組相比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5、Western blot檢測NF-κB P65,p- NF-κB P65蛋白表達：正常對照組與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）,消痰和胃組與維酶素組、模型對照組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（p

11、<0.05）；而維酶素組與模型對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　結論：
　　1、胃癌前病變存在胃黏膜細胞的增殖與凋亡比例失調(diào)。
　　2、將導師胃癌痰證理論進一步完善，從胃癌前病變的角度認識胃癌防治的重要性，并且根據(jù)實驗結果證實從痰論治胃癌前病變合理有效。
　　3、消痰和胃方能改善胃癌前病變大鼠相關癥狀，促進鼠毛再生，增加體重，逆轉胃癌前病變胃黏膜細胞異性增生。
　　4、消痰和胃方可增加胃癌

12、前病變大鼠胃黏膜細胞凋亡指數(shù)，促進胃癌前病變胃黏膜細胞凋亡。
　　5、消痰和胃方可降低胃癌前病變胃黏膜組織中Bcl-2蛋白的表達，提高Bax、Caspase-3蛋白的表達，促進胃癌前病變胃黏膜細胞的凋亡。
　　6、消痰和胃方能降低胃癌前病變胃黏膜組織中NF-κB通路相關蛋白NF-κB P65,p- NF-κB P65的表達，阻斷NF-κB通路的異常激活。說明消痰和胃方逆轉胃癌前病變，促進胃癌前病變胃黏膜細胞凋亡，可能是通過對