Annexin A7與小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)性研究.pdf

1、背景：轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤患者死亡率高、預(yù)后差的根本原因。惡性腫瘤的區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響上皮來源惡性腫瘤患者預(yù)后的最重要因素。研究并最終弄清楚惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的機制，在此基礎(chǔ)上發(fā)展出有效的干預(yù)手段，對于提高惡性腫瘤患者的生存率有重要意義。 Hca-F和Hca-P是利用可移植性小鼠腹水性肝癌細胞(H22)接種于有正常免疫功能的615小鼠足墊，經(jīng)多次淋巴系統(tǒng)篩選得到的兩個來源于同一親本細胞但淋巴道轉(zhuǎn)移能力明顯不同的細胞株。其中Hca-

2、F是具有高轉(zhuǎn)移潛能的細胞株，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于70％；Hca-P是低轉(zhuǎn)移潛能的細胞株，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低于30％。兩株細胞主要差異集中在淋巴道轉(zhuǎn)移表型上。 在本研究組此前針對Hca-F細胞和Hca-P細胞的系列研究中，利用抑制性消減雜交技術(shù)及高通量基因芯片技術(shù)篩選出了在Hca-F細胞和Hca-P細胞的差異表達基因；并采用定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)建立了高低淋巴道轉(zhuǎn)移力小鼠肝癌細胞熒光差異蛋白表達圖譜，經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到17個蛋白質(zhì)，其中膜聯(lián)蛋白7

3、(Annexin A7)在Hca-F細胞中的表達高于Hca-P細胞，提示Annexin A7可能與小鼠肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。由于在人類組織細胞中也有Annexin A7同源蛋白，我們認為研究小鼠肝癌Annexin A7與淋巴道轉(zhuǎn)移機制的相關(guān)性，對人類肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的的防治有重要意義。由此確定以Annexin A7為研究對象，探索其在Hca-F細胞株淋巴道轉(zhuǎn)移過程中的作用，經(jīng)檢索，國內(nèi)外未見同樣的研究報道。 目的：①構(gòu)建pcD

4、NA3.1-Annexin A7表達載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-P細胞并獲得Annexin A7的表達水平顯著上調(diào)的Hca-P細胞株，同時建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的Hca-P細胞株作為對照。②構(gòu)建pSilencer3.1-shRNA表達載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hea-F細胞并獲得Annexin A7的表達水平顯著下調(diào)的Hca-F細胞株，同時建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer 3.1空載體的Hca-F細胞株作為對照。③解析Annexin A7表達水

5、平的改變對小鼠肝癌細胞株Hca-F和Hca-P在細胞周期、細胞凋亡、細胞移動和侵襲能力等方面的影響，由此確定Annexin A7表達水平與小鼠肝癌細胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能間的關(guān)系。 方法：①利用Annexin A7編碼序列(coding sequence，CDS)和PcDNA3.1(+)質(zhì)粒經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后連接純化回收，抽提獲得pcDNA3.1-Annexin A7質(zhì)粒，并行PCR鑒定(鑒定引物為：5’-TGTCT

6、AACCGTTCCAATGACC-3’, 5’-ACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3’這對引物擴增片段包含pcDNA3.1和Annexin A7序列各一部分，長度為923bp，)。在確定pcDNA3.1-Annexin A7質(zhì)粒構(gòu)建成功后行測序鑒定(引物：5’CTCACTATAGGGAGACCCAAGC-3’和 5’-ACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3’)，以確定表達載體中 Annexin A7序列無誤。將pcDN

7、A3.1-Annexin A7表達載體轉(zhuǎn)染Hca-P細胞，并用含400ug/ml G418的完全培養(yǎng)基篩選，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1-Annexin A7表達載體的Hca-P細胞，再行基因組DNA鑒定(引物：5’-TGTCTAACCGTTCCAATGACC-3’：5’-ACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3’)后用熒光定量PCR和Western-blotting分別檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1-Annexin A7表達載體的Hca-

8、P細胞中，Annexin A7在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。②由上海之江生物公司依據(jù)Gene Bank中小鼠Annexin A7基因序列(序列登錄號：NM_009674.3)合成三條shRNA的DNA模板的兩條單鏈，分別命名為AnnexinA25：AnnexinA59；AnnexinA507，將pSilencerTM 3.1-H1 neo質(zhì)粒雙酶切后分別與三條shRNA的DNA模板的退火后產(chǎn)物連接，對三條pSilencer3.1-shR

9、NA表達載體經(jīng)測序鑒定(引物為5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’)確定無誤后。將三條pSilencer3.1-shRNA表達載體分別以脂質(zhì)體法瞬轉(zhuǎn)Hca-F細胞，培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后收集細胞，抽提RNA和蛋白，在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測三條shRNA對Annexin A7的表達的抑制作用，并設(shè)正常的Hca-F細胞為對照，以篩選出RNAi效果最好的shRNA。用RNAi效果最好的shRNA表達載體以脂質(zhì)體法穩(wěn)定

10、轉(zhuǎn)染Hca- F，用含400ug/ml G418的完全培養(yǎng)基篩選，獲得pSilencer3.1-shRNA表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hca-F細胞。從中取兩瓶細胞抽提蛋白、RNA，采用熒光定量PCR和Western-Blottin檢測shRNA轉(zhuǎn)染后Hca-F細胞株中Annexin A7在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達。③以六組細胞(分別為Hca-F細胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pSilencer3.1空載體的Hca-F細胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pSilencer3.1-shRN

11、A表達載體的Hca-F細胞株、Hca-P細胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1空載體的Hca-P細胞株、穩(wěn)轉(zhuǎn)pcDNA3.1-Annexin A7表達載體的Hca-P細胞株)為實驗對象。以MTT法檢測pSilencer3.1-shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)Hca-F細胞、pcDNA3.1-Annexin A7穩(wěn)轉(zhuǎn)Hca-P細胞后對細胞活力和分裂增殖能力的影響；流式細胞技術(shù)檢測pSileneer3.1-shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)Hea-F細胞、peDNA3.1-Annexin

12、 A7穩(wěn)轉(zhuǎn)Hca-P細胞后對細胞周期和細胞凋亡的影響；Transwell實驗檢測pSileneer3.1-shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)Hea-F細胞、pcDNA3.1-Annexin A7穩(wěn)轉(zhuǎn)Hea-P細胞后對細胞遷移能力(不在Transwell上室中加人工基底膜)、和侵襲能力(在Transwell上室中加人工基底膜)的影響。 結(jié)果：①成功構(gòu)建peDNA3.1-Annexin A7表達載體，經(jīng)測序鑒定，所得到的載體中Annexin A7的CD

13、S序列與Gene Bank中小鼠Annexin A7基因序列(序列登錄號：NM 009674.3)一致。peDNA3.1-Annexin A7載體轉(zhuǎn)染Hca-P細胞后，獲得穩(wěn)定上調(diào)表達Annexin A7的Hca-P細胞株：行基因組DNA鑒定，證實peDNA3.1-Annexin A7已轉(zhuǎn)入Hca-P細胞中，western-blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前后蛋白的表達相對值(AnnexinA7/GAPDH)分別為0.43544±0.011

14、2和0.45957±0.0065(P＜0.05)。②pSilencer3.1-shRNA表達載體，經(jīng)DNA測序鑒定，所得到載體中的干擾序列與預(yù)設(shè)序列一致。經(jīng)篩選后，將對Hca-F細胞中Annexin A7的表達抑制效果最好的pSilencer3.1-shRNA表達載體穩(wěn)轉(zhuǎn)Hca-F細胞株，獲得穩(wěn)定下調(diào)表達Annexin A7的Hea-F細胞株；采用熒光定量PCR和Western-Blottin檢測結(jié)果提示：shRNA轉(zhuǎn)染后Hea-F細胞

15、株中AnnexinA7在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達遠低于空載體組和正常Hea-F細胞株(P＜0.05)。③流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果表明Annexin A7有促進細胞分裂增殖的作用：在Hca-F中沉默Annexin A7的表達后，細胞的凋亡數(shù)增加。在Hca-F中沉默Annexin A7表達之后，其遷移能力、侵襲能力均顯著下降，在Hea-P中上調(diào)Annexin A7表達之后，其遷移能力顯著增強，而侵襲能力無明顯變化。 結(jié)論：①利用pcD

16、NA3.1(+)質(zhì)粒和Annexin A7CDS，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-Annexin A7表達載體。該載體轉(zhuǎn)染Hca.P細胞細胞后，經(jīng)含有400ug/ml G418 的完全培養(yǎng)基篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Annexin A7表達載體的Hca-P細胞株?；蚝偷鞍踪|(zhì)水平的檢測表明：Annexin A7在該細胞顯著上調(diào)表達。②利用pSilencerTM 3.1-Hlneo質(zhì)粒和shRNA成功構(gòu)建了pSilencer 3.

17、1-shRNA表達載體，該載體轉(zhuǎn)染Hca-F細胞細胞后，經(jīng)含有400ug/ml G418的完全培養(yǎng)基篩選，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer 3．1-shRNA表達載體的Hca-F細胞株，基因和蛋白質(zhì)水平的檢測表明:Annexin A7在該細胞顯著下調(diào)表達。③Annexin A7作為小鼠肝癌Hca-F和Hca-P細胞株的差異表達蛋白質(zhì)，其高表達能促進腫瘤細胞分裂增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，增強腫瘤細胞的遷移能力和侵襲能力。降低其表達水平可抑制