膜聯(lián)蛋白A7(annexin A7)在胃癌凋亡中作用的研究.pdf

1、胃癌（gastric cancer，GC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人民的健康和生活質(zhì)量。盡管現(xiàn)在我國對胃癌的診斷及治療水平有很大提高，但大多數(shù)胃癌患者就診時已屬中晚期，不能手術(shù)根治，且放化療并未能明顯延長患者的生存期。目前針對胃癌機(jī)制的研究主要集中在增殖、侵襲方面。凋亡是哺乳動物細(xì)胞程序性死亡的主要機(jī)制，大量研究認(rèn)為，凋亡減少是引起腫瘤發(fā)生的重要原因之一。膜聯(lián)蛋白A家族是一類鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族，它們都參與了細(xì)胞

2、許多重要功能的調(diào)節(jié)，如胞飲、胞吐、細(xì)胞骨架、離子通道、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等。膜聯(lián)蛋白A7（annexin A7，ANXA7）也稱為會聯(lián)蛋白（synexin），屬于膜聯(lián)蛋白A家族，在多種腫瘤中表達(dá)異常。目前關(guān)于ANXA7在胃癌凋亡中的作用及其分子機(jī)制仍不明確。
　　本研究應(yīng)用實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）及蛋白印跡法（western blot）檢測胃癌組織和癌旁組織中ANXA7 mRNA和蛋白的表達(dá)；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸

3、附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測胃癌患者及正常人血清中ANXA7，探討ANXA7在胃癌血清及組織中表達(dá)的意義；進(jìn)一步分析胃癌組織中ANXA7表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系。再分別以人不同分化程度胃癌組織、胃癌細(xì)胞株為研究對象，應(yīng)用qRT-PCR、western blot、原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）、流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）等方法分析胃癌中ANXA

4、7的表達(dá)與分化、凋亡的關(guān)系；應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和 RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)，觀察抑制ANXA7表達(dá)對人低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC-823和人胃癌BGC-823細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤凋亡的影響，及對凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9）表達(dá)、caspase-3及caspase-9活性、MAPK信號傳導(dǎo)通路ERK1/2、JNK1/2/3、p38蛋白表達(dá)的影響，為研究ANXA

5、7在胃癌凋亡中的作用以及以ANXA7為新靶點(diǎn)的胃癌分子靶向性治療提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　本研究共分為五個部分：
　　第一部分：膜聯(lián)蛋白A7在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌臨床病理因素的關(guān)系
　　目的：
　　檢測ANXA7在胃癌組織及配對癌旁組織、胃癌患者及正常人血清中的表達(dá)情況，分析ANXA7在胃癌中的意義。
　　方法：
　　選取2013年1月~2015年12月間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院外三科因胃癌入

6、院行根治術(shù)并術(shù)后病理證實(shí)為胃癌的患者105例，收集其晨起空腹血、新鮮胃癌組織及其癌旁組織手術(shù)標(biāo)本。取同期體檢的正常人50例作為對照組。應(yīng)用qRT-PCR及western blot檢測胃癌組織和癌旁組織中ANXA7 mRNA和蛋白的表達(dá)情況；應(yīng)用ELISA法檢測胃癌組及對照組血清中ANXA7，分析ANXA7在胃癌中的意義，并進(jìn)一步分析胃癌組織中ANXA7與臨床病理因素的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR和western

7、 blot技術(shù)檢測105對胃癌組織和配對癌旁組織中ANXA7 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示ANXA7 mRNA和蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.ELISA法檢測胃癌組與正常對照組血清中ANXA7蛋白濃度分別為（78.620±11.249）ng/L、（54.971±9.548）ng/L，胃癌組血清ANXA7蛋白濃度明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。胃癌組與對照組

8、ROC曲線的曲線下面積AUC為0.941，以67.21ng/L為胃癌患者與正常人的臨界值，對胃癌診斷的敏感性為81.90％，特異性為94.0%。
　　3.Spearman相關(guān)分析顯示胃癌組織與外周血中ANXA7蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.607, P<0.05）。
　　4.分析胃癌組織中 ANXA7 mRNA和蛋白水平與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果顯示ANXA7的mRNA和蛋白表達(dá)在不同分化程度的胃癌組織中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、（P<0.05），且隨著分化程度越低，表達(dá)水平越高；在不同腫瘤浸潤深度的組織中，只有T1和T4期組織中ANXA7的mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且 T4期明顯高于T1期；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中ANXA7的mRNA表達(dá)比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中的高，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但ANXA7的蛋白表達(dá)在二者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；胃癌組織中ANXA7的mRNA和蛋白表達(dá)在性別、年齡、腫瘤大小、

10、腫瘤部位、病理類型方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.胃癌組織中ANXA7 mRNA和蛋白表達(dá)高于癌旁組織。
　　2.ANXA7在胃癌患者血清中明顯高于正常對照組，以67.21ng/L為胃癌患者與正常人的臨界值，對胃癌診斷的敏感性為81.90%，特異性為94.0%，ANXA7可能作為新的胃癌血清標(biāo)志物。
　　3.胃癌組織與外周血中ANXA7蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。
　　4.胃癌組織中AN

11、XA7的表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、病理類型無關(guān)。
　　第二部分：膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)與胃癌分化、凋亡相關(guān)性研究
　　目的：
　　檢測高、中、低分化胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中ANXA7的表達(dá)情況及凋亡情況，分析ANXA7表達(dá)與腫瘤分化、凋亡的關(guān)系。
　　方法：
　　收集高、中、低分化胃腺癌組織標(biāo)本105例及人高、中、低分化胃腺癌細(xì)胞株MKN74、SGC7901

12、、BGC823，采用qRT-PCR、western blot檢測ANXA7 mRNA和蛋白的表達(dá)情況；TUNEL法檢測不同分化程度胃癌組織的凋亡情況；FCM檢測不同分化程度胃癌細(xì)胞株的凋亡情況；分析ANXA7的表達(dá)與胃癌分化程度、凋亡的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR和western blot檢測高、中、低分化胃癌組織中ANXA7的表達(dá)，結(jié)果顯示ANXA7在不同分化程度胃癌組織中均表達(dá)，且分化程度越低，表達(dá)越高，差

13、異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；qRT-PCR和western blot檢測高、中、低分化胃癌細(xì)胞株中ANXA7的表達(dá)，結(jié)果顯示ANXA7在不同分化程度胃癌細(xì)胞株中均表達(dá)，且分化程度越低，表達(dá)越高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.TUNEL檢測高、中、低分化胃癌組織的凋亡指數(shù)分別為（18.12±2.40）%、（9.73±1.73）%、（4.13±0.83）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）
　　3.FCM

14、檢測MKN74、SGC7901和BGC823組細(xì)胞凋亡率分別為（10.07±1.21）%、（7.11±1.04）%、（4.25±1.02）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4.Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，人胃癌組織ANXA7 mRNA和蛋白表達(dá)與胃癌分化程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.926，P<0.05；r=-0.950，P<0.05），胃癌組織凋亡指數(shù)與分化程度呈正相關(guān)（r=0.949，P<0.05），胃癌組織凋

15、亡指數(shù)與ANXA7 mRNA和蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.978，P<0.05；r=-0.973，P<0.05）；胃癌細(xì)胞株ANXA7 mRNA和蛋白表達(dá)與胃癌分化程度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.934，P<0.05；r=-0.938，P＜0.05），胃癌細(xì)胞株凋亡率與分化程度呈正相關(guān)（r=0.936，P<0.05），胃癌細(xì)胞株凋亡率與ANXA7 mRNA和蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.917，P<0.05；r=-0.933，P<0.05）。

16、
　　小結(jié)：
　　1.胃癌組織和細(xì)胞株中ANXA7在mRNA和蛋白的表達(dá)與分化程度均呈負(fù)相關(guān)，即隨著胃癌分化程度的下降，ANXA7的表達(dá)逐漸增加。
　　2.胃癌組織和細(xì)胞株中凋亡與分化程度均呈正相關(guān)，即隨著胃癌分化程度的下降，凋亡細(xì)胞隨之減少。
　　3.胃癌組織和細(xì)胞株中ANXA7的表達(dá)水平與凋亡呈負(fù)相關(guān)，即隨著ANXA7表達(dá)增高，凋亡指數(shù)/凋亡率呈下降趨勢。ANXA7對凋亡有抑制作用，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能

17、起到癌基因的作用。
　　第三部分：抑制膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)對胃癌BGC823細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：
　　探討抑制ANXA7表達(dá)對人胃癌BGC823細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9）的影響。
　　方法：
　　構(gòu)建沉默ANXA7的特異siRNA序列轉(zhuǎn)染人低分化胃腺癌細(xì)胞株BGC823，轉(zhuǎn)染靶向ANXA7-siRNA-3的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組（siANXA7組）、轉(zhuǎn)染NS

18、-siRNA的細(xì)胞為陰性對照組（siNS組），空白對照組（Ctrl組）BGC823細(xì)胞不做任何處理。FCM檢測轉(zhuǎn)染前后BGC823細(xì)胞的凋亡率的變化；應(yīng)用qRT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染前后凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspases-3、capase-9 mRNA及蛋白表達(dá)的改變；檢測轉(zhuǎn)染前后caspase-3和caspase-9活性的變化。
　　結(jié)果：
　　1.ANXA7-siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)

19、胞后，qRT-PCR、western blot檢測發(fā)現(xiàn)siANXA7組細(xì)胞ANXA7的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），siNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　2.FCM檢測siANXA7組、siNS組、Ctrl組細(xì)胞凋亡率分別為（24.87±4.80）%、（4.57±0.31）%和（3.89±0.28）%，與Ctrl組及siNS組相比，siANXA7組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P

20、<0.05），siNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.qRT-PCR、western blot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與 Ctrl組及 siNS組相比，siANXA7組細(xì)胞中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減低，而 Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。siAN

21、XA7組caspase-3、caspase-9的活性分別為Ctrl組的2.95倍、3.70倍，較轉(zhuǎn)染前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），上述指標(biāo)siNS組與Ctrl組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.ANXA7-siRNA能有效抑制BGC823細(xì)胞中ANXA7的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　2.ANXA7表達(dá)下調(diào)后BGC823細(xì)胞凋亡率增加，表明ANXA7在胃癌發(fā)生發(fā)展中具有重要的生物

22、學(xué)作用，是胃癌細(xì)胞凋亡的一個重要調(diào)控蛋白，可抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，起到癌基因的作用。
　　3.抑制ANXA7表達(dá)后可能是通過提高caspase-3、caspase-9活性，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)，在促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　第四部分抑制膜聯(lián)蛋白A7表達(dá)對胃癌BGC823細(xì)胞MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　目的：
　　探討抑制ANXA7表達(dá)對MAPK

23、家族中ERK1/2、JNK1/2/3、p38蛋白表達(dá)的影響，分析MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對胃癌凋亡的影響。
　　方法：
　　應(yīng)用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染人胃低分化腺癌細(xì)胞株 BGC823， western blot技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后MAPK家族中ERK1/2、JNK1/2/3、p38蛋白表達(dá)和磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.western blot結(jié)果顯示Ctrl組（空白對照組）、siNS組（陰性對照組）及siANX

24、A7組（實(shí)驗(yàn)組）細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)及其磷酸化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　2.western blot結(jié)果顯示Ctrl組、siNS組及siANXA7組細(xì)胞JNK1/2/3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與Ctrl組及siNS組細(xì)胞相比， siANXA7組 JNK1/2/3的磷酸化水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.western blot結(jié)果顯示Ctrl組、siNS組及s

25、iANXA7組細(xì)胞p38蛋白表達(dá)及其磷酸化水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.抑制ANXA7在BGC823細(xì)胞中表達(dá)，ERK1/2、JNK1/2/3及p38蛋白表達(dá)及ERK1/2、p38磷酸化水平無明顯變化，JNK1/2/3蛋白磷酸化水平明顯下降。
　　2.JNK信號通路可能參與了ANXA7低表達(dá)促進(jìn)胃癌BGC823細(xì)胞凋亡的過程。
　　第五部分：抑制膜聯(lián)蛋白 A7表達(dá)對人胃癌細(xì)胞裸鼠皮

26、下移植瘤凋亡的影響
　　目的：
　　分析抑制ANXA7表達(dá)對人胃癌BGC823細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤凋亡的影響及凋亡相關(guān)基因的改變，進(jìn)一步探討ANXA7在胃癌凋亡中的作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　將人胃低分化腺癌細(xì)胞株BGC823注入裸鼠右側(cè)腋部皮下，建皮下移植瘤模型，成瘤后將重組質(zhì)粒ANXA7-shRNA（shANXA7組）、NS-shRNA（shNS組）及saline（Ctrl組）注入瘤內(nèi)，觀察裸鼠移植瘤的生

27、長情況，測量腫瘤體積和重量；qRT-PCR和western blot檢測ANXA7在各組移植瘤組織中的mRNA和蛋白的表達(dá)；FCM測量各組的凋亡率；qRT-PCR和western blot檢測凋亡相關(guān)基因（Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9）表達(dá)；檢測caspase-3、caspase-9活性。
　　結(jié)果：
　　1.15只實(shí)驗(yàn)裸鼠均見腫瘤生長，移植瘤成瘤率100%。
　　2.qRT-PCR和we

28、stern blot檢測移植瘤ANXA7表達(dá)，結(jié)果顯示與shNS組、Ctrl組相比，shANXA7組ANXA7的mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），shNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.shANXA7組、shNS組、Ctrl組腫瘤體積分別為：(614.72±121.72)mm3、（955.82±152.29）mm3、（1072.65±238.47）mm3，與Ctrl組和sh

29、NS組比較，shANXA7組裸鼠移植瘤體積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），shNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。shANXA7組、shNS組、Ctrl組腫瘤重量分別為：(1.36±0.39)g、（2.13±0.32）g、（2.20±0.34）g，與Ctrl組和shNS組比較，shANXA7組裸鼠移植瘤重量明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），shNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05

30、）；shANXA7組抑瘤率明顯較高。
　　4.FCM檢測shANXA7組、shNS組、Ctrl組移植瘤凋亡率分別為（20.20±0.83）%、（6.10±0.21）%和（6.03±0.12）%，與Ctrl組和shNS組比較，shANXA7組凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），shNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　5.qRT-PCR和western blot檢測各組凋亡相關(guān)基因Bcl-

31、2、Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)，結(jié)果顯示與Ctrl組及shNS組相比，shANXA7組中Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減低，而Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），上述指標(biāo)shNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　6.shANXA7組caspase-3、caspase-9的活性明顯升高，分別為Ctrl組的1.

32、78倍、2.71倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），上述指標(biāo)shNS組與Ctrl組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.成功構(gòu)建BGC823細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤率100%。
　　2.重組質(zhì)粒ANXA7-shRNA能明顯抑制裸鼠移植瘤中ANXA7的表達(dá)，有效抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生長，使移植瘤體積減小、重量減輕。
　　3.抑制ANXA7表達(dá)能促進(jìn)人胃癌裸鼠皮下移植瘤發(fā)生凋亡。

33、r>　　4.抑制ANXA7表達(dá)后促進(jìn)人胃癌BGC823細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤凋亡可能與提高caspase-3和caspase-9活性，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.胃癌組織中ANXA7表達(dá)高于癌旁組織。
　　2.ANXA7在胃癌患者血清中明顯高于正常對照組，ANXA7可能作為新的胃癌血清標(biāo)志物。
　　3.胃癌組織中ANXA7的達(dá)與腫瘤分化程度

34、、腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、病理類型無關(guān)。
　　4.胃癌中ANXA7的表達(dá)與分化、凋亡呈負(fù)相關(guān)。
　　5.抑制ANXA7在BGC823細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞凋亡率增加，可能與提高caspase-3、caspase-9活性，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9表達(dá)有關(guān)。
　　6.抑制ANXA7在BGC823細(xì)胞中表達(dá)JNK1/2/3蛋白的磷酸化水平下降，J

35、NK信號通路可能參與了ANXA7低表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的過程。
　　7.抑制裸鼠移植瘤中ANXA7表達(dá)能有效抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生長，增加裸鼠皮下移植瘤腫瘤細(xì)胞的凋亡率；可能與提高caspase-3和 caspase-9活性，下調(diào) Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)有關(guān)。
　　8.ANXA7在胃癌中可能起到癌基因的作用，是一個重要的分子靶點(diǎn)，ANXA7有可能成為一個可用于胃癌診斷