一個(gè)遺傳性血管性血友病家系的實(shí)驗(yàn)室診斷和分子發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)是由于血管性血友病因子(vonWillebrand fcator，VWF)缺乏或功能異常所致的出血性疾病。根據(jù)發(fā)病原因分為遺傳性和獲得性?xún)纱箢?lèi)。遺傳性血管性血友病主要為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為隱性遺傳。遺傳性vWD的不同分類(lèi)及亞型分型具有不同的分子發(fā)病機(jī)制。研究該病的分子發(fā)病機(jī)制，有助于了解VWF蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，對(duì)于臨床診斷、治療和預(yù)后都有重要的意義。
　

2、　 目的：采用一系列vWD診斷實(shí)驗(yàn)、分型實(shí)驗(yàn)，對(duì)一個(gè)出血性疾病患者及其家系明確診斷，并對(duì)先證者及家系受累成員的血管性血友病因子(VWF)基因進(jìn)行分析，探討其發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：
　　 一)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集實(shí)驗(yàn)(Ristocetin Induced Platelet Aggregation，RIPA)及VW

3、F多聚體電泳等方法分析vWD患者家系三代6位成員臨床表型。
　　 二)PCR擴(kuò)增先證者及家系成員的VWF基因的52個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列并測(cè)序，通過(guò)Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與NM_000552.3序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)檢測(cè)到的突變位點(diǎn)，以含VWF全長(zhǎng)cDNA的表達(dá)質(zhì)粒(pSVVWF)為模板，采用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建突變質(zhì)粒pSVVWFdel6。將野生型VWF質(zhì)粒(wt-pSVVWF)和突變型VWF質(zhì)粒(pSVVWFdel6)轉(zhuǎn)染HE

4、K293細(xì)胞。收集瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的上清和細(xì)胞裂解液。轉(zhuǎn)染后的上清以40倍的比例濃縮。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清及細(xì)胞裂解液中VWF抗原含量，并采用多聚體電泳法對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行VWF多聚體分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、先證者的血漿VWF：Ag為20.5％，血漿FVIII：C為25.0％，VWF：RCo為6.2％，RIPA為28.5％，VWF：CB為3.8％，以上結(jié)果均明顯低于正常參考值。血漿VWF多聚體分析顯示大分子量多聚體缺乏

5、，而血小板VWF多聚體分析無(wú)異常。同時(shí)先證者VWF：Ag/VWF：CB>2，這與以往報(bào)道相一致。
　　 2、與先證者有相似癥狀的四位家系成員的血漿VWF：Ag、VWF：RCo、FVIII：C、RIPA、VWF：CB均明顯低于正常范圍，同時(shí)血漿VWF多聚體分析顯示大分子量多聚體缺乏，血小板VWF多聚體分析無(wú)異常。
　　 3、先證者的VWF基因52個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列擴(kuò)增測(cè)序，發(fā)現(xiàn)第28號(hào)外顯子存在雜合的6個(gè)堿基GATGTG

6、的缺失，導(dǎo)致VWF A2區(qū)的氨基酸D1529-V1530缺失，其四位受累家系成員測(cè)序結(jié)果也有相同的基因的改變。為確定所發(fā)現(xiàn)的VWF基因缺失這一改變屬基因突變還是基因多態(tài)性，我們共檢測(cè)了68位正常人的VWF基因的第28號(hào)外顯子基因，未見(jiàn)該基因改變。
　　 4、野生型及突變型VWF表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞裂解液中VWF抗原含量，突變型與野生型無(wú)明顯差異；而細(xì)胞培養(yǎng)上清中，單轉(zhuǎn)突變體的細(xì)胞上清VWF含量顯著降低，約為野

7、生型的26.89±4.64％，共轉(zhuǎn)突變型和野生型的細(xì)胞上清中VWF含量也顯著降低，為野生型的37.83±5.29％，VWF多聚體分析突變型濃縮上清中VWF大分子量多聚體缺如。
　　 結(jié)論：
　　 1、根據(jù)先證者及受累家系成員臨床癥狀、體征以及VWF相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查，可明確診斷為2A型vWD。
　　 2、基因分析發(fā)現(xiàn)先證者及其他4位家系成員的VWF A2結(jié)構(gòu)域內(nèi)一雜合的6個(gè)堿基GATGTG的缺失，從而導(dǎo)致氨基酸D15