新型多肽在眼部炎癥中的作用及機(jī)制初步研究.pdf

1、目的:
　　胰腺炎相關(guān)蛋白1(pancreatitis-associated protein1,PAP1)是一類由胰腺分泌的內(nèi)源性分泌型蛋白質(zhì),大量研究證明,PAP1在炎性疾病中起到保護(hù)作用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè),在人PAP1中篩選出一段由16個(gè)氨基酸組成的多肽序列(PAPep),通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)眼部炎癥的潛在的抑制作用,并初步探討其抑制炎癥的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.新型抗炎小肽的生物信息學(xué)分

2、析、篩選和合成:本研究采用生物信息學(xué)方法,對(duì)PAP1的原始氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、生物同源性比對(duì)以及氨基酸基本性質(zhì)、生物學(xué)特性的計(jì)算分析,預(yù)測(cè)其抗炎活性氨基酸位點(diǎn)所在,篩選可能具有抗炎活性的多肽序列,并利用固相合成方法合成新型多肽。
　　2.新型抗炎小肽在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎中的作用研究:本研究建立起內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)大鼠模型,通過(guò)玻璃體腔注射PAPep進(jìn)行藥

3、物干預(yù),觀察大鼠炎癥表現(xiàn)、房水蛋白定量、炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)、促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、ICAM-1和MCP-1)檢測(cè)以及組織病理學(xué)觀察等方法通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證活性肽對(duì)眼部炎癥的抑制作用。
　　3.新型小肽抑制炎癥的細(xì)胞分子機(jī)制:本研究通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7建立炎癥細(xì)胞模型,通過(guò)ELISA和RT-PCR檢測(cè)PAPep對(duì)TNF-α和IL-6表達(dá)的影響;進(jìn)一步利用

4、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通過(guò)單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)以及Western Blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子ICAM-1的表達(dá)量以初步探究PAPep抗血管粘附的作用機(jī)制。
　　4.新型小肽抑制炎癥的信號(hào)通路研究:本研究應(yīng)用免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀察PAPep對(duì)NF-κB激活后向RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況的改變;應(yīng)用Western Blot分別

5、檢測(cè)EIU大鼠眼組織以及巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化磷酸化狀態(tài)的改變,以及經(jīng)LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞中MAPK各活性亞基p38 MAPK、ERK和SAPK/JNK的活化磷酸化狀態(tài)的改變情況,初步探討活性肽抑制眼部炎癥的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　結(jié)果:
　　1.新型抗炎小肽的生物信息學(xué)分析、篩選和合成:生物信息學(xué)分析顯示,多肽PAPep不僅含有較多保守殘基,而且具備良好的反應(yīng)特性,包括抗原性、表面接觸活性和親水性

6、等,故從理論角度推測(cè)PAPep可能處于PAP1的功能位點(diǎn)內(nèi),具有抑制炎癥的作用。
　　2.新型抗炎小肽在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠葡萄膜炎中的作用研究:大鼠玻璃體腔注射PAPep可以顯著緩解葡萄膜炎臨床癥狀和評(píng)分,減少前房炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和蛋白滲出,抑制房水及眼組織中TNF-α、IL-6、ICAM-1和MCP-1等促炎性細(xì)胞因子和介質(zhì)的濃度,并改善炎癥引起的眼球組織病理學(xué)改變。
　　3.新型小肽抑制炎癥的細(xì)胞分子機(jī)制:PAPep可劑量依賴

7、性地降低RAW264.7細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的濃度,并抑制細(xì)胞中TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)水平;PAPep可明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的HuVECs中ICAM-1蛋白的表達(dá),并且阻止單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
　　4.新型小肽抑制炎癥的信號(hào)通路研究:PAPep不僅抑制LPS誘導(dǎo)的NF-KB p65向RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移,而且減少了眼組織及細(xì)胞中磷酸化NF-kBp65的蛋白表達(dá)量,且作用呈劑量依賴性;同時(shí)