Trim72在大鼠心力衰竭中的作用及初步機制研究.pdf

1、心肌細胞纖維化會導致包括心力衰竭、心房顫動、心肌缺血、甚至心源性休克等心臟疾病，嚴重危害全人類的健康。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin angiotension aldostenone system，RAAS）與轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是心肌纖維化的主要發(fā)病機制，尤其TGF-β1是目前已知的與組織纖維化的發(fā)生關系最密切的生長因子，具有調(diào)節(jié)細胞生長和分化、促進細胞增殖、

2、抑制炎癥等生物學功能。Tripartite motify-containing72(Trim72)基因共有7個外顯子（又稱為MG53，Gene ID：365377），編碼477個氨基酸，蛋白分子量為53 Kd。Trim72在慢性心衰中的作用及分子機制研究仍不清楚，故本文以SD大鼠為模型，主要研究Trim72在心衰組織中的表達，對心肌成纖維細胞增殖和遷移能力的影響及其分子機制。
　　第一部分：基于生物信息學分析心衰中的差異表達基因<

3、br>　　目的：運用GEO公共數(shù)據(jù)庫中表達譜數(shù)據(jù)，結合生物信息學的方法分析在慢性心衰中的差異基因，參與的生物學過程和信號通路，尋找和心衰密切相關的基因。
　　方法：本部分研究以GEO公共數(shù)據(jù)中的心衰表達譜數(shù)據(jù)為分析材料，運用EC和TAC軟件分析心衰中差異表達的基因，進一步結合生物信息學的方法分析差異基因參與的生物學過程和信號通路，mRNA-mRNA共表達網(wǎng)絡使用Cytoscape進行網(wǎng)絡構建。利用ClueGO插件對基因集做KEGG

4、信號通路，GeneOntology, Reactom通路等富集分析。
　　結果：在獲取表達矩陣后，使用R中Limma包分析兩兩之間的差異表達基因，共有950個差異基因，430個上調(diào)基因，520個下調(diào)基因。采用 GO富集分析950個差異表達基因的生物學過程，發(fā)現(xiàn)它們顯著富集于細胞增殖(cell proliferation)、細胞外基質(zhì)重塑（ECM)、細胞骨架發(fā)育、刺激應答(response to stree)、信號調(diào)控(regula

5、tion ofsignaling)、代謝調(diào)節(jié)(regulation of metabolic process)等生物學過程。結合KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異表達的基因進行Pathway信號通路富集分析，Pathway生物信息學分析結果顯示，差異基因主要富集在TGF signaling pathway、Hippo signaling pathway、PI3k-AKT signaling pathway、Wnt signaling pathway

6、、Cytokine receptor interation signaling pathway等。
　　結論：Trim72可能在心力衰竭的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分：Trim72在SD大鼠心衰模型中的表達
　　目的：構建SD大鼠慢性心衰模型，研究Trim72在SD大鼠慢性心力衰竭模型心臟組織中的表達情況，初步探討Trim72在慢性心力衰竭心肌纖維化發(fā)生和進程中的作用，為Trim72在慢性心衰中的診斷和治療提供理

7、論依據(jù)。
　　方法：我們基于生物信息學分析的結果，預測到Trim72在心臟衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，故本部分采用腹主動脈狹窄法誘導SD大鼠發(fā)生慢性心衰，采用超聲心動、HE和Masson染色法鑒定心衰模型，運用real-time PCR、western blot和免疫組織化學等技術檢測，心衰標本和正常標本組織中Trim72 mRNA和蛋白水平的表達情況。
　　結果：采用腹主動脈狹窄法在 SD大鼠中成功復制了慢性心力衰竭，

8、超聲心動圖和Masson染色結果顯示，SD大鼠慢性心力衰竭模型構建成功。免疫組織化學結果顯示，Trim72在正常 SD大鼠的心臟中低表達或不表達，在慢性心衰SD大鼠心臟中高表達。
　　結論：Trim72在慢性心衰 SD大鼠心臟中高表達，有可能成為一個慢性心衰的輔助診斷標志物。
　　第三部分：沉默MG53對SD大鼠心肌成纖維細胞生物學行為的影響
　　目的：研究沉默Trim72的表達對心肌成纖維細胞增殖和遷移能力的影響，明

9、確Trim72在心肌成纖維細胞中的作用。
　　方法：采用胰酶和膠原酶聯(lián)合消化SD乳鼠的心臟組織，差速貼壁離心法分離心肌成纖維細胞，形態(tài)學觀察和免疫熒光法鑒定心肌成纖維細胞。用原代分離培養(yǎng)的CFs細胞為模型，用小干擾RNA技術沉默CFs細胞中Trim72的表達，實驗分為3組：空白組，陰性對照組，siRNA實驗組。siRNA轉(zhuǎn)染48h和72h后，RealTime PCR及Western blot分別檢測Trim72在mRNA和蛋白水平

10、上的干擾效果。CCK-8實驗檢測沉默Trim72后CFs細胞的增殖變化，Transwell檢測沉默Trim72后CFs細胞的遷移變化。
　　結果：采用胰酶和膠原酶聯(lián)合消化SD乳鼠的心臟組織，差速貼壁離心法分離心肌成纖維細胞，在含10％胎牛血清 DMEM低糖培養(yǎng)基中常規(guī)細胞條件培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下可觀察到細胞形態(tài)呈多樣，細胞胞體較大、平坦，形態(tài)多為紡錘形，無自發(fā)搏動。胞質(zhì)透明，顏色淡，顯得很薄，細胞核較大呈卵圓形，居中，細胞狀態(tài)

11、良好，生長迅速。在熒光顯微鏡下可見細胞呈多角形或梭形，乳鼠心肌成纖維細胞SMA抗原表達呈陽性，細胞純度大于97%。由此可以鑒定為心肌成纖維細胞。siRNA轉(zhuǎn)染48和72h后，Real Time PCR及 Western blot結果顯示，與空白組和陰性對照組相比，實驗組 siRNA能有效沉默Trim72在mRNA和蛋白水平上的表達。CCK-8和Transwell結果顯示，與空白組和陰性對照組相比，實驗組 CFs細胞的增殖和遷移能力明顯下

12、降。
　　結論：沉默Trim72的表達能抑制CFs細胞的增殖和遷移能力。
　　第四部分：初步探討Trim72在心肌成纖維細胞中的分子機制研究
　　目的：初步探討Trim72在心肌成纖維細胞的增殖和遷移能力中的分子機制，尋找Trim72調(diào)控的信號通路和下游靶基因。
　　方法：本部分研究運用基因表達譜芯片尋找Trim72參與的信號通路及下游靶基因；首先，我們運用前期篩選的Trim72-siRNA轉(zhuǎn)染CFs細胞，沉默T

13、rim72的表達，Trizol提取轉(zhuǎn)染48h后的總RNA，利用大鼠基因表達譜芯片分析抑制Trim72表達后基因的表達變化。然后，運用 EC和 TAC等軟件結合生物信息學，對差異表達的基因進行 Gene Ontology和 Pathway信號通路分析，尋找Trim72參與的生物學過程。
　　結果：基因表達譜結果顯示，Trim72-siRNA抑制心肌成纖維細胞中Trim72的表達后，共有265個基因發(fā)生顯著性變化，其中123個基因表達

14、上調(diào)，142個基因表達下調(diào)。GO生物信息學分析結果表明：上述差異表達的基因顯著富集于 Cell adhesion、Skeletal systemdevelopment、Heart development和Extracellular matrix organization等生物學過程；Pathway生物信息學分析結果顯示：差異表達的基因主要富集于TGF-beta signaling pathway、Cell adhesion molecu

15、les(CAMs)、Hippo signaling pathway和Calcium signaling pathway等信號通路。
　　結論：整合差異表達的結果和GO、Pathway結果，我們推測Trim72可能通過 TGF-beta signaling pathway通路發(fā)揮作用， qRT-PCR和Western blot結果也得到了進一步的驗證。這些結果表明，Trim72可能通過上述通路和/或基因的表達變化參心肌成纖維細胞的增