轉基因番茄標記基因剔除及翻譯起始因子4E基因順化植物的病毒抗性.pdf

1、作物遺傳改良依賴于向植物基因組導入外源 DNA 片段。雖然基因工程賦予植物很多通過常規(guī)育種途徑無法實現的優(yōu)良性狀，人們對轉基因作物及其植物產品心存疑慮。植物轉基因研究中抗性標記基因可以提高轉化體的篩選效率。其中70％轉基因植物中采用卡那霉素抗性標記基因。然而，對抗性標記基因潛在的生物安全性疑慮阻礙了植物轉基因研究的發(fā)展，同時現有可利用的標記基因種類有限性也阻礙了轉基因作物的長期利用。解決抗性標記基因安全性問題的策略有標記回避和標記剔除兩

2、類，前者是在轉化階段不使用抗性標記基因或采用安全標記基因篩選轉基因植株；后者則采用抗性標記基因篩選獲得轉化體后剔除標記基因。在剔除策略中，可誘導的自主剔除途徑顯現出較好的利用前景。棉鈴蟲是一種寄主極廣的農業(yè)大害蟲，在蔬菜生產區(qū)主要危害番茄。蘇云金芽孢桿菌毒蛋白(ICP)基因是目前應用最為廣泛的抗蟲基因。本研究內容之一旨在以番茄為受體，通過構建化學誘導剔除載體系統(tǒng)用于從抗蟲轉 Bt 基因植物中剔除標記基因。 對作物遺傳改良的另外一

3、個疑慮是關于外源基因。對于這種顧慮使得研究人員考慮是否能夠向植物基因組導入植物自身基因，而不含其他物種基因，即順化基因植物，以區(qū)別于轉基因植物。植物病毒病給世界各地的農作物生產造成嚴重損失。隨著植物翻譯起始因子特別是 eIF4E的研究深入，植物抗病毒研究將面臨新的課題。病毒侵染寄主植物并在植物體內進行自我復制和增殖需要借助寄主自身蛋白質合成機制。通過植物基因工程途徑，干擾病毒利用植物mRNA翻譯蛋白質的過程，可抑制病毒在寄主植物內的復制

4、和增殖，不僅可獲得抗病毒植物材料，而且可加深對植物-病毒互作分子機理的認識。鑒于此，本研究第二部分內容通過克隆真核翻譯起始因子 4E 相關基因，利用基因失活和正義表達順式調控植物自身eIF4E表達，提高植物對馬鈴薯 Y 病毒屬病毒的抗性，探討eIF4E介導的抗病毒性的作用機理。 本實驗主要開展以下研究： 1．利用位點特異重組系統(tǒng)Cre/lox和化學誘導系統(tǒng) XVE相結合構建標記基因剔除載體p35C，在該系統(tǒng)中，反式激活因

5、子XVE、重組酶基因cre、標記基因nptⅡ構建于識別序列l(wèi)oxP正向重復之間，XVE由位于左側loxP上游的花椰菜花葉病毒35S啟動子驅動，cre由β-雌二醇特異誘導的啟動子驅動，在右側loxP下游構建無啟動子的 cryIAc基因。β-雌二醇誘導處理后，β-雌二醇與反式激活因子 XVE結合，啟動cre基因表達，Cre重組酶識別loxP正向重復位點，發(fā)生重組反應，導致兩個loxP之間的cre、nptⅡ以及 XVE 同時剔除，將剩下一個l

6、oxP位點，同時將cryIAc基因置于35S啟動子驅動下。在載體p35G中，目的基因為gfp，用于通過綠色熒光蛋白檢測標記基因的剔除。 2．通過農桿菌介導的方法進行番茄遺傳轉化。p35G載體轉化番茄中，19個抗性芽，經過于β-雌二醇誘導后，有2個再生芽可以觀測到綠色熒光蛋白的表達，表明該誘導自主剔除系統(tǒng)適用于番茄轉化。通過p35C載體將cryIAc導入番茄品種“中蔬五號”獲得抗性芽，將抗性芽轉移至含有2μM β-雌二醇誘導培養(yǎng)基

7、中生根。選取攜帶單拷貝轉基因番茄植株進行鑒定，對4個轉基因株系的T1進行分析，重組頻率一般在12％～39％之間，完全重組的頻率8％～30％，將標記基因 nptⅡ和cre基因剔除。重組區(qū)域序列分析與預期的重組反應一致。其中株系C4所發(fā)生的重組皆為不完全重組。另外，利用λ噬菌體的兩個重組位點attP構建正向重復序列，置于標記基因兩側，結果表明在轉基因當代和T1代均未檢測到重組植株，可能是由于重組加強序列影響其重組效率。 3．部分轉c

8、ryIAc基因植株的Northern blot結果表明，多數轉基因植株cryIAc的正常轉錄。 4．在轉基因番茄葉片中表達量為3500 ng g<'-1>FW～6300 ng g<'-1>FW，而在果實中CrylAc含量較葉片低，介于2400 ng g<'-1> FW～4400 ng g<'-1>FW之間。對轉基因植株的抗蟲性初步鑒定表明，對棉鈴蟲具有較強的抗性。幼蟲校正死亡率在70％～90％之間，轉基因株系的抗蟲指數在80％～

9、90％之間。 5．分別從克隆了番茄品種“中蔬五號”和抗病辣椒的真核翻譯起始因子4E編碼基因。中蔬五號番茄所獲得的eIF4E與報道的序列有3個堿基差異，而辣椒eIF4E與報道序列一致。 6．構建了辣椒eIF4E正義(超量)表達載體(pCA4S)及番茄eIF4E RNAi抑制表達載體(pLE4D)。 7．以番茄品種“中蔬五號”為受體，通過農桿菌介導的方法用 pCA4S 和 pLE4D兩種載體進行遺傳順化，獲得卡那霉素

10、抗性順化植株13株。PCR檢測和Southernblot 結果表明，目標基因已整合到番茄基因組中。pCA4S載體同時用于辣椒品種蘇椒五號的遺傳順化，4株再生辣椒PCR檢測呈陽性，初步確認基因己整合到番茄基因組。由于在此實驗中所用目的基因 eIF4E來自番茄和辣椒自身，我們暫且稱所獲得的基因工程植株為基因順化植株，盡管它們還攜帶非植物自身基因。 8．通過半定量RT-PCR對基因順化番茄進行eIF4E表達分析，表明pCA4S順化番茄

11、中eIF4E得到超量表達，而pLdE4D順化番茄中eIF4E表達受不同程度抑制。 9．利用摩擦接種對番茄順化植株進行PVY和CMV攻毒感染。通過對接種后的病毒病病情調查和病毒RNA的半定量RT-PCR分析，結果表明，pLE4D 和 pCA4S順化植株相對于對照均獲得不同程度的病毒抗性。其中pCA4S順化植株的抑制病毒效果較差，而pLE4D順化植株的效果較好。就不同病毒而言，無論是正義表達eIF4E或者eIF4E RNA干涉，對P