辣椒根腐疫病抗性基因的標(biāo)記加密及候選基因分析.pdf

1、由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）引起的辣椒疫?。≒hytophthora blight）是一種毀滅性的土傳病害，在世界范圍內(nèi)傳播，是導(dǎo)致辣椒減產(chǎn)的主要因素之一。廣東地區(qū)由于高溫高濕氣候條件的影響，辣椒疫病尤為嚴(yán)重，一旦爆發(fā)，就能導(dǎo)致辣椒大面積絕收。辣椒疫病根據(jù)病原菌侵染部位的不同分為根腐（root rot）、果腐、（fruit rot）莖枯（stem blight）和葉枯（foliar blight）等不同癥狀，

2、其中，辣椒根腐疫?。≒hytophthoraroot rot）的發(fā)生通常直接導(dǎo)致植株不可逆死亡，對(duì)辣椒生產(chǎn)的損害最為嚴(yán)重。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果表明根腐疫病的抗性遺傳機(jī)制從廣義上可分為2種類型，分別為數(shù)量抗性和特異抗性。數(shù)量抗性表現(xiàn)為多基因控制，目前多項(xiàng)研究結(jié)果鑒定并定位的主效根腐疫病抗性基因位于辣椒第5號(hào)染色體；特異抗性為單基因控制，表現(xiàn)為對(duì)某種或少數(shù)幾個(gè)特定生理小種具有完全抗性，而對(duì)其它生理小種不具有抗性。目前為止，國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)根腐疫病

3、特異抗性基因定位的報(bào)道。
　　前期，本課題組從國(guó)外引進(jìn)國(guó)際公認(rèn)辣椒抗疫病材料CM334和高世代純合感病材料 NMCA10399，對(duì)根腐疫病抗性遺傳規(guī)律的研究結(jié)果表明：在廣東省辣椒疫霉菌優(yōu)勢(shì)生理小種 Byl4（Race3）侵染下，根腐疫病抗性性狀為顯性單基因控制（李智軍等2008）。隨后，基于SLAF-seq技術(shù)將抗性基因定位在辣椒第10號(hào)染色體末端約2.6 Mb區(qū)域內(nèi)。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上利用BC1F1群體，并加密標(biāo)記篩選重組株，進(jìn)一

4、步將抗性基因限定在1.5Mb的物理距離內(nèi)，接下來(lái)對(duì)該區(qū)域內(nèi)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并在辣椒疫霉菌脅迫條件下對(duì)預(yù)測(cè)到的抗病相關(guān)基因進(jìn)行基因表達(dá)分析，尋找差異表達(dá)基因；另外，本試驗(yàn)還對(duì)10個(gè)常用內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，篩選出了辣椒疫霉菌脅迫條件下最適合用于辣椒RT-qPCR的內(nèi)參基因。主要結(jié)論如下：
　　1、在前期研究基礎(chǔ)上，在2.6 Mb區(qū)間內(nèi)篩選到SSR多態(tài)標(biāo)記P52-11-34，利用該標(biāo)記及其它10個(gè)現(xiàn)有的連鎖標(biāo)記分析122

5、株BC1F1群體的基因型，并結(jié)合Byl4菌株灌根接種后的表型調(diào)查，將根腐疫病抗性基因進(jìn)一步定位在標(biāo)記 P52-11-34和P52-11-41之間約1.5 Mb的范圍內(nèi)，與兩側(cè)相鄰標(biāo)記的遺傳距離分別為0.3 cM和1.1 cM。
　　2、選擇了10個(gè)常用內(nèi)參基因（ACT、UBI-1、GAPDH、UBI-3、EIF5A2、β-TUB、α-TUB、EF1-α、UBQ、TEF1α），以 CM334和NMCA10399在疫霉菌處理及無(wú)菌水處

6、理后不同時(shí)間點(diǎn)（0 h、12 h、24 h、36 h、48 h）所取幼苗根部的cDNA為模版，利用RT-qPCR方法分析了這10個(gè)基因表達(dá)差異，并通過(guò)geNorm、NormFinder和BestKeeper三個(gè)軟件進(jìn)行內(nèi)參穩(wěn)定分析，最終確定EF1-α為疫霉菌脅迫條件下表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
　　3、對(duì)定位區(qū)段內(nèi)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，共預(yù)測(cè)到94個(gè)基因，其中有26個(gè)抗病相關(guān)基因。在疫霉菌灌根接種后不同時(shí)間點(diǎn)（0 h、12 h、24

7、 h、36 h、48 h）取CM334和NMCA10399幼苗根部，以其cDNA為模版，以無(wú)菌水處理為對(duì)照，EF1-α為內(nèi)參，通過(guò)RT-qPCR對(duì)26個(gè)抗病相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明，在26個(gè)抗病相關(guān)基因中，有8個(gè)基因（CA10g20770、CA10g20470、CA10g20540、CA10g20570、CA10g20630、CA10g20740、CA10g20750和CA10g21040）在抗病材料CM334接菌處理后表達(dá)量上調(diào)