Cetuximab聯(lián)合Erlotinib靶向EGFR治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是世界第六位常見(jiàn)的惡性腫瘤。根據(jù)GLOBOCAN 2002年統(tǒng)計(jì)結(jié)果，全世界每年的肝癌新發(fā)例數(shù)為62.6萬(wàn)，其中我國(guó)就占55％(約34.4萬(wàn))，其發(fā)病率和死亡率均居我國(guó)各種惡性腫瘤的第二位。 作為惡性腫瘤治療領(lǐng)域熱點(diǎn)之一的分子靶向治療，也為肝癌的治療提供了新的思路和希望。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)這一領(lǐng)域的研究熱潮方興未艾，對(duì)各種細(xì)胞表面分子與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究不斷深入，針對(duì)不同分子靶點(diǎn)的新型靶向藥物不斷涌現(xiàn)。其

2、中研究者們對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的研究開(kāi)展較早且深入，針對(duì)EGFR的靶向藥物被陸續(xù)開(kāi)發(fā)出來(lái)，但國(guó)外學(xué)者對(duì)其應(yīng)用和研究多集中于非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等癌種，對(duì)肝癌的治療研究不多。 EGFR是原癌基因cerbB1(HER1)的表達(dá)產(chǎn)物，分子質(zhì)量為170kDa，是一種具有酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)活性的細(xì)胞膜表面糖蛋

3、白受體。目前研究認(rèn)為與EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的途徑最主要有兩條：一條是Ras/Raf/MAPK(ERK)途徑，該途徑主要與細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)化有關(guān)；另一條是PI3-K/AKT途徑，該途徑主要與細(xì)胞增殖、凋亡、運(yùn)動(dòng)等一系列生理功能有關(guān)。 目前靶向EGFR治療惡性腫瘤豐要有兩類藥物，一種是針對(duì)EGFR胞外部分的單克隆抗體，代表藥物為西妥昔單抗(cetuximab)，cetuximab是一種人鼠嵌合抗EGFR的單克隆抗體，與EGFR有

4、很強(qiáng)的親和力，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制EGFR與其配體EGF和TGF-a等的結(jié)合，從而阻斷EGFR的激活和其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，并通過(guò)誘導(dǎo)EGFR的內(nèi)吞、失活，下調(diào)其在胞膜的表達(dá)水平，還可激活抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)，產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞殺傷效應(yīng)；另一種是針對(duì)EGFR胞內(nèi)部分的小分子酪氨酸蛋白激酶抑制劑，代表藥物為厄洛替尼(erlotinib)等，其作用機(jī)制為：與ATP競(jìng)爭(zhēng)EGFR胞內(nèi)部分TPK結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位點(diǎn)，阻斷EGFR的自身磷酸化，

5、從而阻斷由EGFR活化引起的一系列胞內(nèi)級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)，阻止活化信號(hào)傳導(dǎo)至核內(nèi)，使細(xì)胞周期停滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。 本論文的目的在于通過(guò)檢測(cè)肝癌患者腫瘤組織和癌旁肝組織中EGFR及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，分析它們與肝癌患者生存預(yù)后的關(guān)系；觀察cetuximab聯(lián)合erlotinib對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2和Bel-7402的體外增殖抑制作用，探討兩藥之間是否具有協(xié)同效應(yīng)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩藥聯(lián)合誘導(dǎo)HepG2和Bel-

6、7402細(xì)胞凋亡的作用，并應(yīng)用免疫蛋白印跡(Western Blot)法檢測(cè)了凋亡關(guān)鍵蛋白表達(dá)的變化；WB法檢測(cè)兩藥聯(lián)合對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，探討其協(xié)同作用的分子機(jī)制；按照不同序貫的給藥方案，將cetuximab和erlotinib分別與化療藥物聯(lián)合作用于HepG2和Bel-7402細(xì)胞，觀察兩藥的化療增敏效應(yīng)，尋找較為優(yōu)化的治療序貫；還通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察了cetuximab和erlot

7、inib單用或聯(lián)合對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的牛長(zhǎng)抑制作用，及裸鼠對(duì)cetuximab聯(lián)合erlotinib治療的耐受性。通過(guò)上述研究?jī)?nèi)容，探討cetuximab聯(lián)合eriotinib靶向EGFR治療肝癌患者的臨床前景和價(jià)值。 第1章肝癌組織和癌旁肝組織中EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)及其臨床意義1. 第2章 Cetuximab聯(lián)合Erlotinib對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2和Bel-7402的體

8、外增殖抑制作用及其協(xié)同效應(yīng)2. 第3章 Cetuximab聯(lián)合Erlotinib對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響 第4章Cetuximab聯(lián)合Erlotinib對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響. 第5章不同序貫的CetUXimab和Erlotinib與化療藥物聯(lián)合對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞的體外增殖抑制作用 第6章Cetuximab聯(lián)合Erlot

9、inib對(duì)人肝癌移植瘤荷瘤裸鼠模型的體內(nèi)作用研究. 結(jié)論： 1.肝細(xì)胞癌患者的肝癌組織和癌旁肝組織中都可檢測(cè)到EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的高表達(dá)； 2.單因素生存分析表明肝癌組織中EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的激活與本組患者術(shù)后的無(wú)瘤生存時(shí)間和總生存時(shí)間有關(guān)；提示EGFR有可能作為肝癌治療的有效靶點(diǎn)； 3.本組58例患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素是腫瘤最大徑、肉眼癌栓、鏡下子灶； 　　4.本組58

10、例患者術(shù)后總生存時(shí)間的獨(dú)立影響因素足腫瘤最大徑、肉眼癌栓、病理分級(jí)、是否復(fù)發(fā)； 5.單藥cetuximab和erlotinib在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2和Bel-7402的增殖都具有一定的抑制作用，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，二者具有明顯的協(xié)同效應(yīng)； 6.單藥cetuximab和erlotinib能誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細(xì)胞發(fā)生凋亡，增加藥物濃度和延長(zhǎng)作用時(shí)間，細(xì)胞的凋亡率也隨之增加，兩藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，誘導(dǎo)HepG2和Bel

11、-7402細(xì)胞凋亡的作用較單藥時(shí)更強(qiáng)； 7.Cetuximab聯(lián)合erlotinib誘導(dǎo)HepG2和Bel-7402細(xì)胞凋亡的機(jī)制有可能主要是通過(guò)減少p-Bad蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的； 8.Cetuximab聯(lián)合erlotinib對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞的協(xié)同抑制作用的分子機(jī)制主要是通過(guò)進(jìn)一步下調(diào)EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化關(guān)鍵蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的； 9.Cetuximab和erlotinib與化療藥物聯(lián)用對(duì)肝癌細(xì)胞

12、的增殖具有協(xié)同抑制作用，較佳的給藥序貫是化療藥物先于靶向藥物給藥，能獲得明顯的協(xié)同效應(yīng)，這有助于臨床用藥時(shí)降低藥物劑量，減少毒副作用。 10.HepG2和Bel-7402細(xì)胞荷瘤裸鼠對(duì)cetuximab聯(lián)合erlotinib治療的耐受性較好； 11.單藥cetuximab和erlotinib對(duì)HepG2和Bel-7402細(xì)胞裸鼠移植瘤模型具有一定的抑制作用，兩藥聯(lián)合，能更明顯的抑制腫瘤生長(zhǎng)，與對(duì)照組裸鼠相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異