CS-Qdots-PS介導(dǎo)的肝癌靶向基因-光動(dòng)力學(xué)聯(lián)合治療的研究.pdf

1、本研究中，以原發(fā)性肝癌為治療目標(biāo)，以殼聚糖修飾的量子點(diǎn)(CS-Qdots)為基因載體和光動(dòng)力學(xué)治療的介質(zhì)，設(shè)計(jì)了靶向肝癌的基因治療聯(lián)合光動(dòng)力學(xué)治療的體系，并能同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的特異性生物發(fā)光成像。
　　第一部分 CS-Qdots的制備、表征和生物相容性分析
　　目的:研究殼聚糖(chitosan，CS)修飾的CdTe量子點(diǎn)的制備，表征和生物相容性，為其進(jìn)一步治療和成像的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:以水相直接合成法制備水溶

2、性CdTe（碲化鎘）量子點(diǎn)，其表面修飾殼聚糖成為CS-Qdots納米顆粒。運(yùn)用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)、高分辨透射電子顯微鏡(high resolution electron microscopy，HREM)、ZETA電位分析儀、熒光分光光度計(jì)(fluorescence spectrophotometer)、X射線衍射分析(x-ray diffraction，XRD)和傅

3、里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析(Fourier Transform infraredspectroscopy，F(xiàn)TIR)等技術(shù)對(duì)CdTe和CS-Qdots進(jìn)行特性研究;采用細(xì)胞MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)試驗(yàn)檢測(cè)CS-Qdots體外生物相容性;采用體外溶血試驗(yàn)測(cè)定CS-Qdots的血液相容性;以治療濃度將CS-Qdots注射入小鼠尾靜脈后觀察CS-Qdots在小鼠體內(nèi)的分布情況，對(duì)小鼠進(jìn)行肝腎功能分析，血細(xì)

4、胞分析，以及主要臟器的病理學(xué)分析。
　　結(jié)果:制備的CdTe量子點(diǎn)平均粒徑大約5nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為630nm，表面電荷為-16.31±0.10 mV。CdTe表面修飾殼聚糖以后，形成分散性良好，粒徑在20-30nm左右的顆粒，表面帶正電荷（28.02±0.74 mV）。經(jīng)傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析，在FTIR圖譜上顯示出殼聚糖的特征峰。體內(nèi)外的生物相容性試驗(yàn)顯示，相比較CdTe量子點(diǎn)，CS-Qdots具有較好的生物相容性，細(xì)胞毒性

5、評(píng)價(jià)為1級(jí)，且符合醫(yī)用材料的溶血試驗(yàn)要求。經(jīng)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)72小時(shí)以后主要聚集在肝臟，在腎臟有少量分布，極少在肺、心臟和脾臟聚集。以治療濃度（400μg/ml）注入尾靜脈后72小時(shí)，動(dòng)物血清未見明顯的肝腎功能異常，未見明顯的血細(xì)胞計(jì)數(shù)異常，裸鼠主要臟器（肝、腎、肺、心、脾）的病理切片上也未見明顯的炎癥、壞死等異常改變。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了粒徑20-30nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為630nm的CS-Qdots。經(jīng)驗(yàn)證其具有相對(duì)較好的

6、生物相容性，為其進(jìn)一步體內(nèi)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
　　第二部分 肝癌靶向自殺基因p[HRE]AFP-HSVTK和報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc的構(gòu)建
　　目的:在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而實(shí)現(xiàn)自殺基因和報(bào)告基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。
　　方法:通過堿基合成法直接合成甲胎蛋白(AFP，alpha-fetoprotein)啟動(dòng)子的核心區(qū)域(0.3kb)作為下游基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，將來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞生

7、長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）基因的乏氧反應(yīng)序列(hypoxia responsive element，HRE)作為增強(qiáng)子與AFP啟動(dòng)子的5'端融合，得到雜合啟動(dòng)子[HRE]AFP，將其插入載體pCDNA3.1，替換CMV啟動(dòng)子，下游插入自殺基因HSVTK，得到在肝癌內(nèi)特異性表達(dá)的治療基因重組載體p[HRE]AFP-HSVTK。用蟲熒光素酶基因luciferase替換HSVTK

8、片段，得到肝癌報(bào)告基因重組載體p[HRE]AFP-luc。分別用基因測(cè)序和限制性內(nèi)切酶酶切片段電泳方法的檢測(cè)構(gòu)建的質(zhì)粒是否正確。
　　結(jié)果:構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切片段電泳證明插入片段都在正確位置，片段大小正確。測(cè)序顯示，AFP啟動(dòng)子，HRE增強(qiáng)子，自殺基因HSVTK堿基序列與GeneBank內(nèi)相應(yīng)序列比對(duì)完全吻合。
　　結(jié)論:治療基因p[HRE]AFP-HSVTK和報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc構(gòu)建成功。
　　

9、第三部分 CS-Qdots攜帶治療基因和報(bào)告基因在肝癌細(xì)胞內(nèi)的特異性表達(dá)、靶向殺傷效果及活體成像研究
　　目的:檢測(cè)CS-Qdots的轉(zhuǎn)染效率，以其為載體將治療基因和報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至不同細(xì)胞系的細(xì)胞和荷瘤小鼠，檢測(cè)治療基因和報(bào)告基因是否具有肝癌細(xì)胞表達(dá)的特異性，并進(jìn)行靶向殺傷效果及活體成像研究。
　　方法:通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)體系，定量檢測(cè)在不同細(xì)胞系內(nèi)[HRE]AFP啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效率。以p[HRE]AFP-EGFP為報(bào)

10、告基因，檢測(cè)CS-Qdots的基因轉(zhuǎn)染能力。然后以CS-Qdots為載體通過尾靜脈注射對(duì)肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠轉(zhuǎn)染報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠體內(nèi)的生物發(fā)光信號(hào)。再用CS-Qdots將p[HRE]AFP-HSVTK轉(zhuǎn)染至將肝癌細(xì)胞和非肝癌細(xì)胞內(nèi)，于乏氧前后檢測(cè)加入GCV后細(xì)胞的增殖率，以檢測(cè)自殺基因?qū)Ω伟┑陌邢驓芰Α?br>　　結(jié)果:CS-Qdots具有穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力，并且可以在體內(nèi)

11、外對(duì)基因的運(yùn)載進(jìn)行示蹤。報(bào)告基因p[HRE]AFP-luc轉(zhuǎn)染至甲胎蛋白表達(dá)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞HepG2、陰性的肝癌細(xì)胞SMMC7721，成纖維細(xì)胞L929和結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO后的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，乏氧誘導(dǎo)下蟲熒光素酶的相對(duì)表達(dá)值在HepG2細(xì)胞內(nèi)增加了2.8倍，在SMMC7721細(xì)胞內(nèi)增加了5.2倍，而在L929和LOVO細(xì)胞內(nèi)乏氧誘導(dǎo)前后幾乎不能檢測(cè)到蟲熒光素酶基因的表達(dá)。p[HRE]AFP-luc報(bào)告基因被CS-Qd

12、ots運(yùn)送進(jìn)入裸鼠體內(nèi)后，通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能在腫瘤部位檢測(cè)到明顯的生物發(fā)光信號(hào)。CS-Qdots/p[HRE]AFP-HSVTK轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞(HepG2和SMMC7721)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比顯示出對(duì)GCV的敏感性(p＜0.001)，且乏氧誘導(dǎo)后敏感性提高(p＜0.001)。而轉(zhuǎn)染的非肝癌細(xì)胞，無論乏氧誘導(dǎo)與否，與未處理細(xì)胞相比都缺乏對(duì)GCV的治療敏感性(p＞0.05)。
　　結(jié)論:CS-Qdots可以作為一種穩(wěn)定的可示蹤的

13、基因載體用于體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染。[HRE]AFP雜合啟動(dòng)子介導(dǎo)的下游基因具有在肝癌細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)并可被乏氧誘導(dǎo)增強(qiáng)的特性，其介導(dǎo)的HSV-TK/GCV治療體系僅對(duì)肝癌細(xì)胞敏感，介導(dǎo)的luc報(bào)告基因表達(dá)還可用于肝癌的早期診斷和成像。
　　第四部分 CS-Qdots/PS介導(dǎo)的肝癌靶向基因治療聯(lián)合FUEL-FRET光動(dòng)力學(xué)治療
　　目的:通過體內(nèi)外試驗(yàn)證明CS-Qdots能通過“非結(jié)合的生物發(fā)光激發(fā)熒光”的方式（fluoresce

14、nce by unbound excitation from luminescence，F(xiàn)UEL）被激發(fā)，并能將能量通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方式（fluorescent resonce energy transfer，F(xiàn)RET）轉(zhuǎn)移給光敏劑，引發(fā)光動(dòng)力學(xué)治療效應(yīng)。并檢測(cè)體內(nèi)外基因治療聯(lián)合FUEL-FRET光動(dòng)力學(xué)治療對(duì)肝癌的殺傷作用。
　　方法:通過細(xì)胞外直接激發(fā)、體內(nèi)外生物發(fā)光光譜檢測(cè)的方法，證明CS-Qdots可以被細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的

15、生物發(fā)光直接激發(fā)。將光敏劑卟吩姆鈉與CdTe量子點(diǎn)共同包裹于殼聚糖中構(gòu)成CS-Qdots/PS納米粒，以其作為載體，轉(zhuǎn)染p[HRE]AFP-luc至HepG2細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧簇，還原型谷胱甘肽(GSH)，總GSH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及還原型GSH與GSSG的比例，從而檢測(cè)細(xì)胞在氧化壓力下對(duì)還原型GSH的消耗;檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase3的活性;并用MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增值率。對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外基因治療、FUEL-

16、FRET光動(dòng)力學(xué)治療以及二者的聯(lián)合治療，通過細(xì)胞增殖率、瘤體在體生長(zhǎng)速度、瘤體質(zhì)量等指標(biāo)檢測(cè)各組治療方法的抑瘤效果，并檢測(cè)裸鼠的肝腎功能、血細(xì)胞分析、主要臟器的病理改變來分析治療方法對(duì)裸鼠主要臟器和生理功能的影響。
　　結(jié)果:試驗(yàn)結(jié)果證明CS-Qdots可以通過FUEL的方式被生物發(fā)光信號(hào)直接激活，檢測(cè)到的生物發(fā)光信號(hào)的最大發(fā)射波長(zhǎng)從560nm躍遷到630nm。用含有光敏劑的CS-Qdots/PS將p[HRE]AFP-luc基因轉(zhuǎn)

17、染至肝癌細(xì)胞后，在避光條件下加入底物后，相比較未處理細(xì)胞陰性對(duì)照組，檢測(cè)到細(xì)胞中了產(chǎn)生的大量活性氧簇(ROS)，還原型GSH被消耗，GSSG含量上升，細(xì)胞caspase3活性上升。體內(nèi)外的抑瘤試驗(yàn)中，與單獨(dú)治療組相比較，基因治療聯(lián)合FUEL-FRET光動(dòng)力學(xué)治療組取得最明顯的抑瘤效果，腫瘤生長(zhǎng)速度顯著下降。通過對(duì)體內(nèi)試驗(yàn)中FUEL-FRET光動(dòng)力治療組的瘤體細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，光動(dòng)力學(xué)治療組的細(xì)胞產(chǎn)生大量空泡，線粒體受損嚴(yán)重，各