靶向小鼠肝癌干-祖細胞免疫治療的實驗研究.pdf

1、研究背景：現(xiàn)有研究表明，腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要根源之一。雖然手術(shù)、放療和化療等方法能夠有效清除實體腫塊或減低腫瘤負荷，取得了一定臨床療效。但腫瘤干細胞的自我更新、高增殖和耐化療藥等自我保護的特性，使得常規(guī)手段難以清除組織、血液等機體內(nèi)殘留的腫瘤干細胞，成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的隱患。
　　過繼細胞免疫療法(ACI)作為繼手術(shù)、放療、化療之后第四大治療措施已應(yīng)用于臨床腫瘤的治療。2010年針對去勢術(shù)后復(fù)發(fā)前列腺癌的DC疫苗研究與

2、臨床應(yīng)用取得了中位生存期延長的歷史性突破。但至今關(guān)于靶向腫瘤干細胞的治療性研究特別是免疫治療的報道很少。由于腫瘤干細胞與正常組織干細胞均比較原始且十分相似，免疫細胞難以識別，這給靶向腫瘤干細胞的免疫治療提出了挑戰(zhàn)。我們認為，腫瘤組織是由非均質(zhì)細胞構(gòu)成的，其中包含數(shù)量極少的干細胞和初步分化并啟動增殖的祖細胞。這些進入快速細胞分裂狀態(tài)、初步分化的，且保留干性的腫瘤祖細胞，對于腫瘤形成和發(fā)展具有重要的生物學意義；與原始的腫瘤干細胞相比更能被免

3、疫細胞有效識別，具有重要的治療意義。因此，我們假設(shè)腫瘤祖細胞可以成為腫瘤免疫治療的特異性標靶，由其作為抗原誘導的腫瘤免疫治療，可能阻止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　研究目的：利用干細胞中ALDH(乙醛脫氫酶)高表達的特性，在腫瘤細胞中分選ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg細胞亞群，鑒定其生物學特性，以不同干性細胞亞群作為抗原，制備DC疫苗并誘導腫瘤特異性CTLs，評價其治療效果，為靶向腫瘤干/祖細胞的免疫治療奠定基礎(chǔ)。

4、r>　　研究方法：1)以流式細胞術(shù)檢測小鼠肝癌H22，人胃癌BGC-823、結(jié)腸癌LS-174T、肝癌SMMC-7721細胞以及胰腺癌SW-1990和Panc-1細胞系中ALDH+細胞的表達；2)在確定ALDH陽性表達的細胞中，以ALDH表達的高低差異，將小鼠肝癌H22細胞分選并定義為ALDHhigh、ALDHlow、ALDHneg細胞亞群；3)對分選出的小鼠肝癌H22細胞系中三種細胞亞群進行CD133&CD44表型分析；4)對分選出的

5、小鼠H22三種細胞亞群進行細胞周期分析；5)將分選出的小鼠肝癌H22各亞群細胞在干細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察球體形成；6)將分選出的小鼠肝癌H22各亞群細胞分別以不同數(shù)量級在小鼠背部皮下注射致瘤，觀察成瘤情況并繪制生長曲線；7)分別以分選出的小鼠肝癌H22不同亞群細胞作為抗原制備小鼠CTL細胞，于H22肝癌細胞荷瘤昆明小鼠的瘤周進行注射，觀察療效，計算抑瘤率、脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。
　　研究結(jié)果：1)在小鼠肝癌H22細胞、人結(jié)腸癌LS-1

6、74T細胞、胰腺癌SW-1990細胞和Panc-1細胞中存在著ALDH陽性表達，而在人胃癌BGC-823細胞和肝癌SMMC-7721細胞中未見ALDH表達。2)在小鼠肝癌H22細胞中能明確分選出存在熒光差異的三群細胞即ALDHhigh，ALDHlow和ALDHneg細胞亞群。3)H22細胞的ALDHhigh，ALDHlow，ALDHneg三個亞群中CD133&CD44表達存在差異，其表達比例依次減少。4)H22細胞中ALDHhigh曲亞

7、群主要處于G0/G1期，ALDHlow亞群處于s期，而ALDHneg亞群則處于G2/M期；5)ALDHhigh亞群細胞可形成細胞球體，ALDHlow和ALDHneg亞群細胞不能形成球體；6)ALDHlow亞群在接種2×102個細胞和2×104個細胞時，腫瘤的生長趨勢和平均體積均高于其它兩亞群。7)以ALDHlow亞群細胞作為抗原制備的小鼠CTL細胞抑瘤率達到71％，高于ALDHhigh(56％)和ALDHneg亞群細胞(51％)(P<0

8、.01)，其脾指數(shù)與胸腺指數(shù)較其它兩亞群增高，但無統(tǒng)計學差異。
　　研究結(jié)論：1)在小鼠肝癌H22細胞、人結(jié)腸癌LS-174T細胞、胰腺癌SW-1990細胞和Panc-1細胞中存在著ALDH陽性的腫瘤干細胞；2)在小鼠肝癌H22細胞中能明確分選出干性不同的ALDHhhigh(干細胞)，ALDHlow(祖細胞)和ALDHneg(終末細胞)亞群；3)小鼠肝癌H22細胞中存在的祖細胞，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵亞群細胞，且以其為抗原誘導DC制