胎兒附屬組織來源干-祖細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、近年來，國內(nèi)外已經(jīng)認(rèn)識到成體干細(xì)胞可以作為細(xì)胞治療或基因治療的種子細(xì)胞，但仍然存在像異體移植免疫排斥、來源困難、體外擴(kuò)增不易控制等成體干細(xì)胞應(yīng)用的主要障礙。分離擴(kuò)增成體干細(xì)胞以提供充足的移植細(xì)胞，是應(yīng)用的關(guān)鍵。胎兒附屬物是胎兒出生時除胎兒以外的其他組織，包括胎盤、臍帶、臍血、胎膜、羊水等。以往的處理是在胎兒出生后將這些附帶組織廢棄。隨著近年來干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展逐漸認(rèn)識到，在胎兒附屬物中包含了大量具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。由于取材方便且無創(chuàng)傷、

2、沒有倫理問題、可以在長期保存后作為自體治療的良好材料等諸多優(yōu)勢，從胎兒附屬物中分離成體干細(xì)胞逐漸成為新的研究熱點(diǎn)。如果能夠建立從胎兒附屬物中分離純化擴(kuò)增成體干細(xì)胞的技術(shù)，將為臨床疾病的細(xì)胞治療和基因治療提供新的具有廣闊前景的種子細(xì)胞來源，同時也為探討胚胎發(fā)生、組織細(xì)胞分化等發(fā)育生物學(xué)問題提供細(xì)胞模型。我們的研究就是圍繞上述問題展開，選擇臍血、胎膜、胎盤為研究材料，分離培養(yǎng)擴(kuò)增具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性、安全性及低溫生物學(xué)、基

3、因轉(zhuǎn)染等與臨床應(yīng)用密切聯(lián)系的問題，為今后的自體化細(xì)胞治療和基因治療提供可靠的實驗基礎(chǔ)。 本文首先從胎兒附屬組織中分離各種具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，如臍血來源內(nèi)皮祖細(xì)胞、胎膜組織貼壁細(xì)胞、臍帶血管周細(xì)胞，優(yōu)化并穩(wěn)定培養(yǎng)條件；通過生長曲線、流式細(xì)胞技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)、集落培養(yǎng)、細(xì)胞功能測定、誘導(dǎo)分化等實驗鑒定所分離細(xì)胞的生物學(xué)特性；其次，通過低溫凍存前后比較，觀察低溫長期保存對上述細(xì)胞的影響；此外，通過核型分析和體內(nèi)體外致瘤性實驗對胎兒

4、附屬組織分離干細(xì)胞的安全性進(jìn)行評價；最后，利用上述鑒定并評價的干細(xì)胞作為基因治療的靶細(xì)胞，嘗試不同的體外轉(zhuǎn)染方法如脂轉(zhuǎn)、電轉(zhuǎn)，以夏家輝院士發(fā)明的“人源基因載體”介導(dǎo)標(biāo)記基因來探討胎兒附屬組織來源干細(xì)胞作為基因治療靶細(xì)胞的實驗方法。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)臍血來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞：可在體外進(jìn)行長期傳代培養(yǎng)，群體倍增水平可達(dá)42代，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原，具有內(nèi)吞ac．LDL，結(jié)合UEA-1的內(nèi)皮細(xì)胞特性及體外成血管的能力，分離培養(yǎng)的不同代次的

5、內(nèi)皮細(xì)胞均具有正常核型，未見致瘤性。(2)胎膜組織貼壁細(xì)胞：具有良好的增殖能力，表達(dá)CD44、CD29，不表達(dá)CD34、CDI4、CD45，經(jīng)誘導(dǎo)后能夠分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞，傳代多次后核型正常，未見致瘤性。(3)臍帶血管周細(xì)胞：具有間質(zhì)細(xì)胞的表型特征，如表達(dá)CD29、CD44等表面標(biāo)志物。并且通過CFU-F形成實驗證實，所培養(yǎng)的臍帶來源貼壁培養(yǎng)細(xì)胞具有自我增殖能力，推測它們具有干／祖細(xì)胞特性。(4)凍存前后上述細(xì)胞凍存生物學(xué)特性未見

6、明顯差別，并且凍存的胎盤組織中也可以分離得到胎盤來源貼壁細(xì)胞，表型與新鮮組織分離細(xì)胞無差別。(5)通過脂轉(zhuǎn)或電轉(zhuǎn)方法可以介導(dǎo)人源基因載體攜帶外源標(biāo)記基因在上述細(xì)胞得到表達(dá)。結(jié)果表明：(1)胎兒附屬組織中可以分離得到大量具有干／祖細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，如臍血來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞、胎膜組織貼壁細(xì)胞、臍帶血管周細(xì)胞；(2)上述細(xì)胞具有較高的增殖潛能，在體外傳代可以大量擴(kuò)增，長期傳代具有一定安全性。(3)胎兒附屬組織中的干／祖細(xì)胞或胎盤組織可以通過凍