雙功能重組蛋白靶向免疫治療腫瘤研究.pdf

1、第一部分、可激活免疫細(xì)胞靶向EGFR高表達(dá)腫瘤細(xì)胞重組蛋白的設(shè)計、表達(dá)及對腫瘤的治療作用
　　腫瘤靶向治療是當(dāng)前癌癥治療的研究熱點，并代表未來發(fā)展的方向。而腫瘤免疫治療是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種腫瘤治療模式—腫瘤生物治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。有效地將兩者結(jié)合起來是研發(fā)新型抗腫瘤藥物的一大趨勢。目前在抗腫瘤靶向藥物的開發(fā)中，表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)是公認(rèn)的、

2、選用最多的靶向治療靶點?，F(xiàn)在臨床上主要有兩大類EGFR靶向的抗腫瘤藥物:一，小分子酪氨酸激酶抑制劑(small-molecule tyrosine kinaseinhibitors，TKIs);二，單克隆抗體(monoclonal antibodies，mAbs)。但是在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)有顯著一部分患者對這兩類藥物均明顯耐藥，而最初敏感的患者在經(jīng)過治療后，轉(zhuǎn)而發(fā)展為耐藥，最終導(dǎo)致預(yù)后較差。通過分子水平的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)這種耐藥多是由于EGFR

3、激酶結(jié)構(gòu)域存在突變，或其下游信號通路的持續(xù)活化造成。在這種情況下，腫瘤細(xì)胞不再依賴表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)結(jié)合EGFR的啟動激活信號，卻可以持續(xù)地生長增殖，腫瘤細(xì)胞呈自主性生長狀態(tài)。因此針對EGF-EGFR信號不敏感的腫瘤細(xì)胞，需要新的治療方法。本研究旨在開發(fā)能夠靶向免疫治療該類腫瘤的重組蛋白類藥物，即新型的Biosimilar。為充分調(diào)動機(jī)體的免疫系統(tǒng)，將抗腫瘤免疫治療機(jī)制運用至新型藥物中

4、，本研究將顯性抗原肽構(gòu)建至重組蛋白，組成一個EGFR靶向的雙功能重組免疫調(diào)節(jié)蛋白，用于高表達(dá)EGFR腫瘤的治療。本研究采用EGFR的天然配體EGF作為靶向結(jié)合載體，將其與來自李斯特菌溶細(xì)胞素O(Listeriolysin O，LLO)的3個顯性T細(xì)胞表位融合，通過序列拼接構(gòu)建了重組融合蛋白pLLO-hEGF。人EGF是一個由53個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量小，與EGFR的親和力高。而LLO是一個已經(jīng)證實的強(qiáng)大的免疫原性分子，具有豐

5、富的CD4+和CD8+T細(xì)胞抗原表位。本研究選用了經(jīng)文獻(xiàn)證實的2個CD4+和1個CD8+T細(xì)胞表位。所構(gòu)建的重組蛋白pLLO-hEGF經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析，理論分子量僅為16 kDa，性質(zhì)穩(wěn)定，血管穿透性將優(yōu)于mAb。同時該重組蛋白應(yīng)具有2種功能:既可以通過EGF靶向結(jié)合高表達(dá)EGFR腫瘤細(xì)胞，同時其LLO的顯性抗原表位又可以充分活化機(jī)體的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞部位聚集，從而加強(qiáng)攻擊和殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮靶向免疫治療腫瘤的作用。<

6、br>　　我們首先采用生物工程的分子克隆技術(shù)以及蛋白表達(dá)純化技術(shù)，成功克隆表達(dá)和獲得了可溶性雙功能重組蛋白pLLO-hEGF，4L重組菌液量可得(4.5～6) mL濃度為800μg/mL左右（最大1.0 mg/ml）的純化蛋白。接下來通過Western blot篩選了高表達(dá)EGFR的人腫瘤細(xì)胞系，從不同細(xì)胞系中各挑選出2種，包括人乳腺癌(MDA-MB-231、SK-BR-3)、人肺癌(A549、NCI-H157)和人結(jié)直腸癌(HCT11

7、6、HT-29)，用于雙功能重組蛋白pLLO-hEGF相關(guān)的功能研究。細(xì)胞免疫化學(xué)熒光染色實驗結(jié)果顯示了pLLO-hEGF可以很好地靶向結(jié)合這些腫瘤細(xì)胞表面。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示pLLO-hEGF對這些腫瘤細(xì)胞不產(chǎn)生促增殖作用。其免疫激活作用研究結(jié)果顯示:pLLO-hEGF可使體外培養(yǎng)的人外周血單個核細(xì)胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)中CD3+CD4+T細(xì)胞明顯增殖。單次實驗結(jié)果顯示p

8、LLO-hEGF刺激14天時PBMCs中CD3+CD4+T細(xì)胞百分比可增至54.5％，而對照組為44.8％。且刺激增殖活化的T淋巴細(xì)胞在體內(nèi)外實驗中均顯示出顯著的殺傷腫瘤細(xì)胞作用。體外對上述幾種表達(dá)EGFR腫瘤細(xì)胞的殺傷率分別為:HCT116，(69.89±1.05)％; HT-29,(60.40±2.33)％; A549,(49.45±1.72)％; NCI-H157,(85.26±4.82)％; SK-BR-3，(47.90±1.3

9、9)％。體內(nèi)移植瘤模型實驗結(jié)果顯示，將刺激增殖的T淋巴細(xì)胞注射裸小鼠體內(nèi)，顯著抑制了腫瘤的生長，平均瘤重(0.178/0.224 g)明顯小于對照組(0.550 g)（*P＜0.05）。綜上所述，我們的研究提供了一種研發(fā)新型抗腫瘤藥物的新思路和新策略。
　　此部分內(nèi)容申請了國家發(fā)明專利（申請?zhí)?201410152549.2），目前在實審階段，且相關(guān)內(nèi)容已發(fā)表于Hum Vaccin Immunother(Human vaccines

10、)(IF=3.643)和CellPhysiol Biochem雜志(IF=3.55)。
　　第二部分、可激活免疫細(xì)胞靶向CD20陽性人淋巴瘤細(xì)胞重組蛋白的設(shè)計、表達(dá)及抗淋巴瘤作用的初步研究
　　B細(xì)胞淋巴瘤是一種血液系統(tǒng)疾病，采用傳統(tǒng)治療手段臨床療效較差。隨著對CD20分子結(jié)構(gòu)特點的認(rèn)識，抗CD20單克隆抗體的設(shè)計開發(fā)在B細(xì)胞淋巴瘤的臨床治療中取得重要進(jìn)展。其中最具代表性的是1997年美國FDA批準(zhǔn)上市的人鼠嵌合抗CD20單

11、克隆抗體—Rituximab（C2B8，美羅華）。但人鼠嵌合抗體由于其分子量大，穿透力弱，且毒副作用大，明顯限制了其臨床效果。近年來，一些人源化抗體、小型或改型抗體、基因修飾抗體逐漸發(fā)展起來。其中單鏈抗體(single chainvariable fragments，ScFv)由于其分子量小、穿透力強(qiáng)、能夠較好地保持抗原親和性等特點，成為應(yīng)用生物工程方法進(jìn)行腫瘤免疫治療的一種重要手段。本研究同樣利用LLO的顯性抗原肽設(shè)計、構(gòu)建了靶向CD

12、20陽性B細(xì)胞淋巴瘤的雙功能重組蛋白ScFv-pLLO。首先，我們設(shè)計了針對人CD20的ScFv序列，然后將LLO顯性抗原肽與ScFv序列拼接，使構(gòu)建的重組蛋白既可靶向結(jié)合CD20陽性B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，同時其LLO抗原表位又可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗原性，從而充分激活機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮更長效的抗腫瘤免疫，達(dá)到靶向免疫治療的效果。
　　雙功能重組蛋白ScFv-pLLO經(jīng)原核克隆、表達(dá)和純化，并初步分析了其抗B細(xì)胞淋巴瘤作用。生物信息學(xué)

13、軟件分析顯示重組蛋白理論分子量為32 kDa，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。流式細(xì)胞術(shù)定量分析幾種人淋巴瘤細(xì)胞系細(xì)胞表面CD20表達(dá)情況，結(jié)果顯示Daudi細(xì)胞CD20陽性率在98％以上，Raji和NCI-BL2009細(xì)胞CD20陽性率分別為89.7％和92.2％，而RAMOS細(xì)胞CD20陽性率是52.3％。流式細(xì)胞術(shù)分析ScFv-pLLO靶向結(jié)合人淋巴瘤細(xì)胞的能力，結(jié)果顯示ScFv-pLLO可不同程度的靶向結(jié)合CD20表達(dá)水平不同的人淋巴瘤細(xì)胞，其濃

14、度為10μg/mL時，對Daudi和NCI-BL2009細(xì)胞的平均結(jié)合率分別為(93.25±3.45)％和(73.85±3.95)％。免疫共沉淀實驗結(jié)果進(jìn)一步證明ScFv-pLLO可特異靶向結(jié)合人淋巴瘤細(xì)胞表面的CD20分子。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示ScFv-pLLO可抑制Raji細(xì)胞的生長，而對Daudi、RAMOS和NCI-BL2009淋巴瘤細(xì)胞的生長無影響。凋亡實驗結(jié)果顯示ScFv-pLLO可直接誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，20μg/mL的

15、ScFv-pLLO作用24 h后，可誘導(dǎo)24.6％的Raji細(xì)胞凋亡（早期+晚期），作用48 h后，Raji細(xì)胞總凋亡率可達(dá)47.0％。本研究的初步結(jié)果顯示，雙功能重組蛋白ScFv-pLLO可特異靶向結(jié)合CD20陽性B細(xì)胞淋巴瘤，對某些人淋巴瘤細(xì)胞系，如Raji細(xì)胞，可直接誘導(dǎo)其凋亡，結(jié)構(gòu)和功能上類似“小型抗體”。同時，雙功能重組蛋白ScFv-pLLO由于攜帶顯性抗原肽，不同于純粹的單克隆抗體，其靶向結(jié)合淋巴瘤細(xì)胞表面CD20分子后可增

16、強(qiáng)腫瘤細(xì)胞激活免疫系統(tǒng)的能力，從而為我們下一步研究其對免疫細(xì)胞的激活作用以及激發(fā)長效抗腫瘤細(xì)胞免疫的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　此部分內(nèi)容已發(fā)表于《中國免疫學(xué)雜志》。
　　第三部分、Leptin在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，在腫瘤靶向治療中，不斷有新的候選抗腫瘤靶點出現(xiàn)。近幾年，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Leptin介導(dǎo)的信號在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和腫瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)生成中發(fā)揮了重要作用，并被認(rèn)

17、為是潛在的有效抗腫瘤靶向治療靶點。Leptin的中文名稱為瘦素，是一種由167個氨基酸組成的非糖基化蛋白質(zhì)類激素，主要由脂肪細(xì)胞分泌，參與機(jī)體的能量代謝。研究表明腫瘤組織也可表達(dá)Leptin及其受體（LEPR/Ob-R），其中較多數(shù)據(jù)顯示結(jié)直腸癌的惡性程度與Leptin的表達(dá)量密切相關(guān)。一些實驗結(jié)果顯示高濃度的外源性Leptin可以促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)其運動和侵襲能力。但目前較少關(guān)于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性Leptin在腫瘤細(xì)胞

18、生長和侵襲力方面確切生物學(xué)作用的研究，而明確Leptin介導(dǎo)的信號通路對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，有助于開發(fā)新型抗腫瘤靶向治療藥物。
　　在研究中，我們首先分析了幾種人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中Leptin及其受體LEPR的表達(dá)情況，包括mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示人結(jié)直腸癌細(xì)胞系均普遍表達(dá)Leptin和LEPR，包括細(xì)胞系HCT116、HT-29、COLO201、COLO205和SW480。以人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT-29細(xì)胞為

19、例，我們用siRNA有效敲低了腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源性Leptin的表達(dá)。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示，抑制內(nèi)源性Leptin的表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT-29細(xì)胞的增殖無影響。然后我們通過Real-time PCR檢測了一些與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)基因的表達(dá)情況，包括MMP1、MMP9、TIMP-1、E-cadherin、Twist等。結(jié)果顯示，抑制內(nèi)源性Leptin表達(dá)，HCT116細(xì)胞中MMP1和MMP9的表達(dá)明顯上調(diào)（*P＜

20、0.05），TIMP-1、TIMP-2和E-cadherin的表達(dá)明顯下調(diào)（*P＜0.05）;HT-29細(xì)胞中，MMP1和Vimentin的表達(dá)明顯上調(diào)（*P＜0.05），TIMP-2的表達(dá)明顯下調(diào)（*P＜0.05）。以HCT116為例，Western blot進(jìn)一步檢測蛋白表達(dá)水平變化，其結(jié)果與mRNA水平變化一致。此外，明膠酶譜實驗結(jié)果顯示，抑制內(nèi)源性Leptin表達(dá)，HCT116細(xì)胞中MMP9的蛋白裂解活性增強(qiáng)。Transwell

21、體外侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組穿膜細(xì)胞數(shù)(148±17)相比，HCT116細(xì)胞Leptin RNAi組穿出小室微孔膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多(512±23)（*P＜0.05），表明HCT116細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　本研究不同于以往的研究，重點分析了抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)源性Leptin的表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，降低Leptin的表達(dá)對細(xì)胞增殖無影響，但卻明顯增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲能力。而以往的研究結(jié)果是提高Lept