多重置換擴(kuò)增(MDA)結(jié)合多重PCR-Y染色體微缺失檢測(cè)方法的探究.pdf

1、目的：⑴通過(guò)對(duì)男性原發(fā)不育患者Y染色體微缺失的分析研究，探討Y染色體微缺失的臨床意義，為臨床進(jìn)行男性不育的診斷、治療以及輔助生殖技術(shù)提供相應(yīng)的理論依據(jù)。⑵回顧性分析Y染色體微缺失患者行ICSI-ET治療的胚胎受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、妊娠率及早期流產(chǎn)率等指標(biāo)，初步探討Y染色體微缺失是否影響ICSI治療結(jié)局。⑶通過(guò)多重置換擴(kuò)增(MDA)聯(lián)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)建立單細(xì)胞AZF檢測(cè)方法，為臨床Y染色體微缺失患者植入前胚胎行AZF檢測(cè)提供新

2、的方法，為患者合理選擇移植胚胎和更確切的遺傳學(xué)咨詢提供依據(jù)。
　　 方法：①以2012年1月～2012年10月于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心就診的男性原發(fā)無(wú)精子癥、嚴(yán)重少弱精子癥和少精子癥患者122例為研究對(duì)象。所有患者均按照世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的方法和診斷標(biāo)準(zhǔn)加以確診，排除內(nèi)分泌失調(diào)及輸精管阻塞等因素。留取上述患者外周血2 mL，乙二胺四乙酸鹽(EDTA)抗凝，標(biāo)本在檢測(cè)前置-20℃冰箱保存。選取30例已正常生育的健康男

3、性為對(duì)照。采用鹽析法提取DNA，選取15個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)，包括AZFa區(qū)的sY82、sY84、sY86，AZFb區(qū)的sY124、sY127、sY128、sY133、sY134、sY143，AZFc區(qū)的sY239、sY242、sY254、sY255，AZFd區(qū)的sY145、sY152。將這15個(gè)位點(diǎn)組成4套多重PCR系統(tǒng)，分別為系統(tǒng)Ⅰ:SRY、sY254、sY143、sY242、sY255，系統(tǒng)Ⅱ: SRY、sY84、sY23

4、9、sY152，系統(tǒng)Ⅲ: SRY、sY86、sY127、sY145、sY124，系統(tǒng)Ⅳ: SRY、sY134、sY82、sY128、sY133。每套系統(tǒng)中以SRY基因作為內(nèi)對(duì)照，同時(shí)以空白和已正常生育的男性作外對(duì)照。②回顧性分析5例Y染色體微缺失患者的6個(gè)ICSI周期和同期治療的無(wú)Y染色體微缺失的嚴(yán)重少弱精子癥或無(wú)精子癥患者的胚胎情況，共57例62個(gè)ICSI周期，所有患者精液分析均按WHO標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)2次精液分析并經(jīng)離心沉淀均無(wú)精子者為無(wú)

5、精子癥，精子濃度＜5×106/ml者為嚴(yán)重少精子癥。所有患者均排除染色體核型異常且行Y染色體微缺失檢測(cè)。觀察分析兩組間患者的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率和早期流產(chǎn)率。③選取天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療的86例男性原發(fā)不育患者為研究對(duì)象，提取外周血DNA及單淋巴細(xì)胞，采用MDA方法對(duì)單/兩個(gè)淋巴細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增成功的單淋巴細(xì)胞行性別鑒定（采用DYZ1/DX

6、Z1引物，引物序列如下:DYZ1:5'-TCCACTTTATTCCAGGCCTGTCC-3',5'-TTGAATGGAATGGGAACGAATGG-3'DXZ1:5'-AATGTGCAAGTGGCTATTTAGCG-3'5'-TCCATCATAAGGAATGTTCAGCT-3')，最后行AZF微缺失檢測(cè)。比較外周血DNA AZF檢測(cè)結(jié)果和單/兩個(gè)淋巴細(xì)胞MDA擴(kuò)增后的AZF檢測(cè)結(jié)果，檢驗(yàn)單細(xì)胞MDA-PCR-AZF檢測(cè)方法的可行性和準(zhǔn)確

7、性。
　　 結(jié)果：⑴本研究收集男性不育患者122例，檢出AZF基因微缺失患者共12例，總?cè)笔蕿?.8％(12/122)，其中無(wú)精子癥組、嚴(yán)重少弱精子癥組和少精子癥組患者的缺失率分別是11.1％(5/45)、10.9％(6/55)、4.5％(1/22);對(duì)照組30例正常男性均未發(fā)現(xiàn)AZF基因微缺失。12例AZF微缺失患者中，9例AZFc缺失，8例AZFd缺失，3例AZFa缺失。AZF缺失類型有3種，其中AZFc+d缺失8例，AZ

8、Fa缺失3例，AZFc缺失1例。無(wú)精子癥組和嚴(yán)重少弱精子癥組患者Y染色體微缺失率明顯高于少精子癥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。Y染色體微缺失對(duì)男性不育有重大影響，是造成男性不育的重要原因之一。⑵Y染色體微缺失組患者的受精率明顯低于無(wú)Y染色體微缺失組（P＜0.05），兩組間患者的胚胎卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率和早期流產(chǎn)率的差異不明顯（P＞0.05）。提示Y染色體微缺失對(duì)ICSI治療結(jié)局可能有一定影響，但

9、需大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。⑶本研究中86例男性單淋巴細(xì)胞MDA擴(kuò)增成功率為98.8％(85/86)，30例女性淋巴細(xì)胞MDA擴(kuò)增均成功，成功率為100％。⑷性別鑒定結(jié)果:MDA擴(kuò)增成功的淋巴細(xì)胞行性別鑒定，性別均與其血來(lái)源相符，陰性對(duì)照和空白對(duì)照均未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果。可以認(rèn)為性別鑒定引物選擇合適，性別鑒定成功率為100％。⑸AZF檢測(cè)結(jié)果:86例男性不育患者外周血DNA中共檢出9例Y染色體微缺失，缺失率為10.5％(9/86)，其中3例為AZF

10、a(SY84)缺失，4例為AZFc+d缺失(SY254、SY255、SY242、SY239、SY125)，1例為AZFb缺失(SY134);1例為AZFc缺失(SY254、SY255)。85例單淋巴細(xì)胞 MDA擴(kuò)增成功患者AZF檢測(cè)總成功率為97.6％(83/85)，其中無(wú)缺失組76例男性患者單淋巴細(xì)胞AZF檢測(cè)成功率為98.7％(75/76)，一例出現(xiàn)AZFb(SY134)缺失，AZF檢測(cè)結(jié)果符合率98.7％(74/75);9例缺失患

11、者中AZF檢測(cè)成功率88.9％(8/9)，AZF缺失類型與外周血完全一致，符合率100％，其中2例AZFa(SY84)缺失，4例AZFc+d缺失(SY254、SY255、SY242、SY239、SY125)，1例AZFb缺失(SY134)，1例AZFc缺失(SY254、SY255)。
　　 結(jié)論：①進(jìn)一步確定Y染色體微缺失是引起男性不育的一個(gè)重要原因，臨床治療中，該類患者應(yīng)常規(guī)行Y染色體微缺失檢測(cè)，并為患者提供遺傳咨詢，同時(shí)為是

12、否需要行植入前遺傳學(xué)診斷提供臨床依據(jù)。②Y染色體微缺失可能對(duì)ICSI-ET治療結(jié)局有一定影響，可造成受精率降低，但卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率等差異不明顯，故Y染色體微缺失對(duì)ICSI治療的影響還需更大樣本量的研究證實(shí)。③本實(shí)驗(yàn)成功建立了MDA-PCR-AZF方法對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)一步完善了單細(xì)胞多重置換擴(kuò)增方法，提高擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞的成功率。為臨床ICSI治療Y染色體微缺失患者提供新的方法，具有重要的臨床應(yīng)