嚴重少精子和無精子的不育患者Y染色體微缺失的研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分：特發(fā)性不育和伴有精索靜脈曲張或隱睪的非特發(fā)性不育患者Y染色體微缺失的研究 目的：本研究的目的是評估國人中男性特發(fā)性不育和伴有精索靜脈曲張或隱睪的非特發(fā)性不育患者Y染色體微缺失發(fā)生的頻率，并探討Y染色體微缺失檢測的臨床意義。 材料和方法： 2 003年7月～2005年3月143例嚴重少精子癥(2～5×10<'6>/ml)和無精子癥患者均來自男性不育癥門診。其中36例因隱睪行睪丸下

2、降固定術，手術時間為1.5～3.0歲，平均2.1歲，其中嚴重少精子癥21例，無精子癥15例；45例因精索靜脈曲張而行精索內(nèi)靜脈高位結(jié)扎術，手術時間為19～32歲，平均23歲，其中嚴重少精子癥30例，無精子癥15例；62例診斷為特發(fā)性不育(idiopathicinfertility)，其中嚴重少精子癥29例，無精子癥33例。所有的患者都有正常的46XY核型；睪丸體積采用國際通用的睪丸體積測量器測量，睪丸大小在正常范圍內(nèi)(15～25ml)；

3、 卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和睪丸激素(testosterone，T)通過放射免疫法(radio immunoassay，RIA)來測定。男性特發(fā)性不育患者均通過臨床檢查排除精索靜脈曲張、附睪損傷、隱睪、阻塞性無子精癥或其他泌尿生殖系疾患。無精子癥和嚴重少精子癥患者的精液標本需連續(xù)3次，每次間隔3周，隨后經(jīng)3 d禁欲后獲得，并符合世界衛(wèi)生組織的診斷標準。不育癥患者的睪丸結(jié)構通過雙側(cè)睪

4、丸細針穿刺細胞學(fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)來分析。此外，40例健康生育男性和1例女性作為對照。 基因組DNA來自外周血細胞樣本并在-20℃保存。8對引物為AZFa區(qū)的sY84和sY86，AZFb區(qū)的sY127和sY134，AZFc區(qū)的sY254和sY255以及作為內(nèi)對照的SRY(Sex determining region，sY14)和鋅指蛋白基因(zFY)。兩個多重聚合酶鏈反應

5、(Polymerase chain reaction，PCR)包括：Mix1：SRY(sY14)-ZFY-sY84-sY134-sY255和Mix2：SRY(sY14)-ZFY-sY86-sY127-sY254．空白、女性和健康男性生育者DNA作為外部對照。為排除假陽性反應，對微缺失的標本進行3次PCR重復檢測，上述缺失仍無擴增信號，而SY14(sRY)和ZFY均能正常擴增，則證實微缺失的存在。 使用STATA 7．0統(tǒng)計軟件。

6、用確切概率法分析3組(特發(fā)性不育組，非特發(fā)性不育組和對照組)Y染色體微缺失發(fā)生的頻率；分析嚴重少精子癥和無精子癥患者中特發(fā)性不育組和非特發(fā)性不育組Y染色體微缺失發(fā)生的頻率；分析2組(嚴重少精子癥組和無精子癥組)Y染色體微缺失發(fā)生的頻率。P<0.05為顯著性差異，有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1．本研究的檢測結(jié)果顯示在特發(fā)性不育患者中Y染色體微缺失發(fā)生率是19.4％，重要的是在非特發(fā)性不育患者中微缺失發(fā)生率也達11.1％。按照目

7、前的約定認為特發(fā)性無精子癥和嚴重少精子癥患者應進行Y染色體微缺失的檢測?；谖覀兊难芯?，建議Y染色體微缺失的檢測應包括特發(fā)性不育和非特發(fā)性不育，特別是尋求經(jīng)卵胞內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治療的患者。 2．本研究已經(jīng)檢測到有一部分患者是由于Y染色體上AZF區(qū)的微缺失而造成的生精障礙，但是，大部分患者無精子或少精子的原因不清楚，這可能是因為存在某些更微小的缺失或點突變，

8、或因為某些精子發(fā)生相關基因位于所研究的區(qū)域之外，甚至位于常染色體上，因此有必要再去尋找新的精子發(fā)生基因。 第二部分：特發(fā)性不育患者外周血和睪丸組織中Y染色體微缺失的比較研究 目的：本研究的目的是比較研究國人中男性特發(fā)性不育患者外周血和睪丸組織中Y染色體微缺失是否存在不同，并探討Y染色體微缺失檢測的臨床意義。 材料和方法：62例特發(fā)性不育患者來自男性不育癥門診。其中嚴重少精子癥(2～5×10<'6>/ml)29例，

9、無精子癥33例。所有的患者都有正常的46XY核型；睪丸體積采用國際通用的睪丸體積測量器測量，睪丸大小在正常范圍內(nèi)(15～25ml)；性激素促卵泡素和睪丸激素通過放射免疫法來測定。男性特發(fā)性不育患者均通過臨床檢查排除精索靜脈曲張、附睪損傷、隱睪、阻塞性無子精癥或其他泌尿生殖系疾患。無精子癥和嚴重少精子癥患者的精液標本需連續(xù)3次，每次間隔3周，隨后經(jīng)3d禁欲后獲得，并符合世界衛(wèi)生組織的診斷標準。不育癥患者的睪丸結(jié)構通過雙側(cè)睪丸細針穿刺細胞學

10、來分析。此外，40例健康生育男性和1例女性作為對照。 基因組DNA來自外周血細胞樣本并在-20℃保存。8對引物為AZFa區(qū)的sY84和sY86，AZFb區(qū)的sY127和sY134，AZFc區(qū)的sY254和sY255以及作為內(nèi)對照的SRY(sY14)和ZFY。兩個多重聚合酶鏈反應(PCR)包括：Mix1：SRY(sY14)-ZFY-sY84-sY134-sY255和Mix2：SRY(sY14)-ZFY-sY86-sY127-sY2

11、54．空白、女性和健康男性生育者DNA作為外部對照。 所有患者睪丸標本均通過FNAC取得，并立即保存在液氮中。應用Trizol方法從液氮冷凍組織中提取總RNA，在AMV反轉(zhuǎn)錄酶作用下完成由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的過程。聚合酶鏈反應(PCR)包括：SRY(sY14)-DFFRY-RBM-DAz-β-actin。人β-actin作為cDNA模板的陽性對照。 結(jié)論： 1．本研究的檢測結(jié)果初步顯示在特發(fā)性不育患者睪丸組織

12、也存在Y染色體微缺失。睪丸組織RT-PCR的檢測也有助于確定特發(fā)性不育的病因。 2．ICSI是目前治療男性不育的重要手段之一，它能使不育夫婦產(chǎn)生后代，但也能使遺傳缺陷傳給下一代。事實上，睪丸生殖細胞中的微缺失能夠產(chǎn)生帶有微缺失的精子，假如這些精子與卵細胞相遇，將產(chǎn)生一個帶有Y染色體微缺失的個體，后代繼承了他父親生殖細胞中的微缺失。本研究表明特發(fā)性不育患者睪丸組織RT-PCR和外周血PCR檢測有助于TESE-ICSI治療，避免遺傳