Y染色體STR和SNP復(fù)合檢測(cè)方法的研究.pdf

1、【目的 為提高Y染色體遺傳標(biāo)記的個(gè)人識(shí)別能力和非父排除能力，建立Y-STR的復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)和新一代遺傳標(biāo)記Y-SNP的檢測(cè)方法十分必要。本課題旨在構(gòu)建九個(gè)Y-STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系，以期為法醫(yī)Y-STR分型提供新的技術(shù)手段。建立多重Y-SNP單堿基引物延伸反應(yīng)，掌握多重單堿基引物延伸反應(yīng)的一般規(guī)律，為高通量分析Y-SNP提供基礎(chǔ)。方法選定9個(gè)Y-STR基因座，應(yīng)用加尾引物設(shè)計(jì)策略，構(gòu)建9個(gè)基因座的Y-STR復(fù)合擴(kuò)增熒光檢測(cè)體系。依

2、據(jù)DNA分析技術(shù)工作組(TWGDAM)指南進(jìn)行法醫(yī)學(xué)可行性研究和群體遺傳學(xué)研究。選定3個(gè)Y-SNP，設(shè)計(jì)PCR引物和延伸引物，建立3個(gè)Y-SNP的多重單堿基引物延伸反應(yīng)。利用在完全變性條件下HPLC對(duì)DNA片段的分析是按其長(zhǎng)度和序列進(jìn)行分離的原理，建立3個(gè)Y-SNP復(fù)合檢測(cè)方法。并進(jìn)行法醫(yī)學(xué)可行性研究和群體遺傳學(xué)研究。結(jié)果構(gòu)建了9個(gè)Y-STR基因座：DYS434、GATA-A10、DYS438、DYS439、DYS531、DYS557、

3、DYS448、DYS456，DYS444復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)體系(HY-9-plex)。法醫(yī)學(xué)可行性研究結(jié)果顯示，敏感度檢驗(yàn)最低模板量HY-9-plex體系為0.5ng；分型結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，能夠?qū)ΤＲ?jiàn)基質(zhì)上的斑痕正確分型，具有很好的組織同一性、種屬特異性，可以耐受高女性成分的干擾，用于混合斑分析具有優(yōu)勢(shì)，可以用于實(shí)際檢案。在120個(gè)男性樣本中檢出105個(gè)單倍型，單倍型變異度為0.9968，標(biāo)準(zhǔn)誤為0002。 成功的建立了M9、M35

4、、M98多重單堿基引物延伸反應(yīng)。在WAVE核酸片段分析儀上，應(yīng)用反相離子對(duì)變性高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了3個(gè)Y-SNP的復(fù)合檢測(cè)。法醫(yī)學(xué)可行性研究結(jié)果顯示，檢驗(yàn)最低模板量為0.5ng，分型結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，對(duì)法醫(yī)學(xué)常見(jiàn)的生物檢材包括毛發(fā)、血痕、精斑、煙蒂等均獲得明確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在105個(gè)男性樣本中檢出四種單倍型，單倍型變異度為0.5104，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.014。 結(jié)論本研究引入加尾引物設(shè)計(jì)策略，成功的構(gòu)建了9個(gè)Y-STR基因座的HY-

5、9-plex復(fù)合擴(kuò)增體系。為Y染色體STR鑒別能力的提高提供了一種新的快速、高效及自動(dòng)化的檢測(cè)分析手段。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中全部采用國(guó)產(chǎn)的Taq酶，擴(kuò)增效率和特異性與進(jìn)口的Taq酶比較無(wú)明顯差異，為試劑國(guó)產(chǎn)化進(jìn)行了有效的探索。 通過(guò)建立3個(gè)Y-SNP的多重SNuPE反應(yīng)，揭示單堿基引物延伸反應(yīng)的關(guān)鍵是選擇合適的DNA聚合酶及引物和模板的比例。利用在完全變性條件下HPLC對(duì)DNA片段的分析是按其長(zhǎng)度和序列進(jìn)行分離的原理，實(shí)現(xiàn)了多重單堿基引物