潮汕地區(qū)漢族群體10個新Y染色體STR基因座的遺傳多態(tài)性及復(fù)合擴增研究.pdf

1、目的：旨在篩選更多新的Y-STR基因座，提高Y-STR單倍型的鑒別能力。選取10個新Y-STR基因座，對其中適合MiniSTR引物設(shè)計的基因座，進行MiniSTR引物設(shè)計；通過對10個Y-STR基因座在潮汕地區(qū)漢族群體中的遺傳多態(tài)性調(diào)查，分析它們的等位基因序列和單倍型，為等位基因命名提供依據(jù)，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；根據(jù)群體調(diào)查結(jié)果，選出其中符合條件的基因座，應(yīng)用銀染復(fù)合擴增技術(shù)，組建Y-STR復(fù)合擴增體系，依據(jù)DNA分析技術(shù)工作組(

2、TWGDAM)指南進行法醫(yī)學(xué)可行性研究，以建立檢測結(jié)果可靠、具有較高個人識別能力的檢測方法。
　　 方法：利用BLAT軟件對GDB數(shù)據(jù)庫中的Y-STR基因座進行種屬特異性分析，依據(jù)具有良好種屬特異性、重復(fù)序列為單拷貝、重復(fù)單位為四或五核苷酸的原則，篩選出10個新Y-STR基因座DYS522、YS549、DYS556、DYS565、DYS568、DYS570、DYS588、DYS593、DYS594、DYS598；用primer

3、3.0軟件和BLAT軟件，根據(jù)Y-MiniSTR引物設(shè)計原則，對DYS565、DYS568、DYS593、DYS594和DYS598基因座重新進行MiniSTR引物設(shè)計，其它基因座引物則采用GDB的引物序列。應(yīng)用PCR反應(yīng)，對實驗DNA樣本進行單基因座PCR擴增，擴增產(chǎn)物采用非變性聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)緩沖體系垂直電泳分型，銀染法顯色檢測；用女性樣本和常見動物樣本，實驗檢測10個Y-STR基因座的Y染色體特異性和種屬特異性；對潮汕地區(qū)漢族1

4、59名無關(guān)男性個體樣本進行分型檢測，各基因座的等位基因測序后，按國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(ISFG)推薦的命名原則命名；采用直接計數(shù)法計算10個Y-STR基因座的等位基因頻率和單倍型頻率；用家系樣本、毛干樣本DNA作為模板，檢測Y-STR基因座的突變率和分析降解DNA的能力。在群體調(diào)查結(jié)果基礎(chǔ)上，依據(jù)銀染復(fù)合擴增位點選擇的原則，選出符合條件的Y-STR基因座，通過優(yōu)化復(fù)合擴增條件，建立復(fù)合擴增體系；擴增產(chǎn)物應(yīng)用非變性聚丙烯酰胺凝膠連續(xù)緩沖體系垂

5、直電泳分型、銀染顯色檢測；用不同DNA含量樣本、不同組織樣本、不同載體上的血痕作模板，對復(fù)合擴增體系進行測試。
　　 結(jié)果：⑴應(yīng)用e-PCR對10個基因座進行種屬特異性分析，各基因座的DNA序列只與人類基因組DNA完全匹配，未見其他動物基因組DNA中存在相同序列；用10個Y-STR基因座的引物，擴增女性樣本和常見動物樣本DNA，均未檢測到擴增產(chǎn)物。⑵10個Y-STR基因座的擴增產(chǎn)物均只檢測到一條帶，非特異性產(chǎn)物少，分型效果良好。

6、⑶10個Y-STR基因座除DYS588和DYS593外，其余均為簡單重復(fù)序列Y-STR。它們在潮汕地區(qū)漢族人群中的擴增片段長度在108~372bp之間，其中DYS593擴增片段長度最小，DYS522最大。⑷潮汕地區(qū)漢族159名無關(guān)男性個體中，DYS522、YS549、DYS556、DYS565、DYS568、DYS570、DYS588、DYS593、DYS594、DYS598基因座分別檢測出7、5、5、4、6、9、8、4、4、4個等位基

7、因，基因變異度在0.1434 (DYS565)~0.7994 (DYS570)之間；10個Y-STR基因座，共觀察到138種不同的單倍型，單倍型變異度為0.9973，標(biāo)準誤為0.00069。通過30個2代父子家系樣本分析，10個Y-STR基因座單倍型一致，未觀察到突變。⑸10個Y-STR基因座中擴增片段長度小于130bp的DYS565、DYS568、DYS593、DYS598基因座，可對毛干DNA進行檢測分型。⑹選出了5個Y-STR基因

8、座建立兩組Y-STR復(fù)合擴增銀染檢測體系：MultiplexⅠ為DYS549、DYS556和DYS594，MultiplexⅡ為DYS570和DYS593；電泳結(jié)果顯示：兩組Y-STR銀染復(fù)合擴增體系的各基因座間擴增產(chǎn)物平衡，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后可對其進行準確分型，且與單基因座擴增結(jié)果一致。法醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究結(jié)果顯示：兩組復(fù)合擴增體系具有良好的男性特異性和較高的種屬特異性，最低DNA檢出量達0.5ng；同一個體不同組織器官DNA分型結(jié)

9、果一致；對涂在不同載體上的血痕可進行分型，同一樣本分型一致。經(jīng)群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，5個基因座在潮汕地區(qū)漢族159名男性樣本中共觀察到97種單倍型，單倍型變異度為0.99，標(biāo)準誤為0.0013。
　　 結(jié)論：①篩選的10個Y-STR基因座都是單拷貝的Y染色體特異性STR基因座，具有很好的種屬特異性和穩(wěn)定的父系遺傳，可用于法醫(yī)學(xué)混合斑跡分析和父權(quán)關(guān)系的鑒定。②分析了10個Y-STR基因座的等位基因序列，調(diào)查了它們在潮汕地區(qū)漢族人群中

10、的遺傳多態(tài)性，為比較不同群體間的數(shù)據(jù)提供了依據(jù)，豐富了我國人類遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫。③10個Y-STR基因座的單倍型變異度為0.9973，其構(gòu)成的單倍型具有較高的個人識別率和非父排除率，能夠有效提高Y染色體的鑒別能力。④證實了小于130bp的小片段MiniSTR可對毛干DNA進行檢測分型，提示對于高度降解的DNA檢材能夠準確分型。⑤建立了兩組Y-STR復(fù)合擴增銀染檢測體系：MultiplexⅠ和MultiplexⅡ；兩組體系檢測結(jié)果可靠，價格低