Ezrin的重組表達(dá)及其在胰腺癌血清檢測(cè)、蛋白相互作用中的應(yīng)用研究.pdf

1、胰腺癌惡性程度很高，常較早發(fā)生轉(zhuǎn)移，同時(shí)對(duì)絕大多數(shù)化療藥物不敏感，使胰腺癌的治療極為困難。腫瘤標(biāo)記物是腫瘤早期診斷的有效工具，當(dāng)前唯一應(yīng)用的胰腺癌標(biāo)志物是CA19-9，但其特異性不好。因此，迫切需要靈敏度和特異性更好的標(biāo)志物用于胰腺癌診斷。 Ezrin是在各種腫瘤組織中表達(dá)均升高的蛋白，本實(shí)驗(yàn)室通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也驗(yàn)證了其在胰腺癌組織中的高表達(dá)，有望成為胰腺癌或廣譜腫瘤標(biāo)記物。但是，一個(gè)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的生物標(biāo)志物應(yīng)能夠方便地

2、在血清、尿液和唾液等易獲得的體液中檢測(cè)到。經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，Ezrin可以Ⅲ型方式分泌，即通過分泌小泡、分泌小體的形式分泌到細(xì)胞外，有文獻(xiàn)[1]也在腫瘤組織培養(yǎng)上清中檢測(cè)到Ezrin的存在，所以Ezrin可能在腫瘤血清中存在。由于其表達(dá)水平的異常還可能刺激機(jī)體產(chǎn)生自身抗體，并且有研究[2]已經(jīng)在獲得性再生障礙性貧血病人血清中檢測(cè)到了Moesin的自身抗體，所以，本研究擬以原核重組表達(dá)的Ezrin為基礎(chǔ)，分別建立檢測(cè)血清中Ezrin抗原

3、和自身抗體的ELISA方法，判斷兩者是否可作為胰腺癌的標(biāo)記物。 Ezrin蛋白結(jié)構(gòu)中存在與多種蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，Ezrin的高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且近期的研究顯示[3，4]，在腫瘤轉(zhuǎn)移中是通過與其他蛋白形成復(fù)合物而行使作用的，所以了解更多的Ezrin相互作用蛋白對(duì)闡明其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制有重要作用。本研究擬篩選到更多的Ezrin相互作用蛋白，為闡明其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 第一章、 Ezrin的重組表

4、達(dá)及純化 目的：構(gòu)建含有Ezrin基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，純化。 方法：提取人胰腺癌Panc-1細(xì)胞總RNA，RT-PCR法擴(kuò)增Ezrin基因。將擴(kuò)增得到的Ezrin基因片段和pET15b質(zhì)粒連接，獲得pET15b-Ezrin重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.

5、 coli DH5α，雙酶切后測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21-CodonPlus（DE3）-RIL，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ni2+-NTA親和層析和分子篩純化后，行SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜分析和western-blot鑒定。 結(jié)果：RT-PCR擴(kuò)增出的Ezrin基因片段（1761bp）與理論DNA表達(dá)片段大小一致，測(cè)序鑒定顯示克隆的Ezrin基因序列與GenB

6、ank報(bào)道序列相符。SDS-PAGE、質(zhì)譜分析顯示純化后Ezrin重組蛋白純度較好，含有少量的降解片段，western-blot分析顯示，Ezrin重組蛋白與兔抗Moesin多克隆抗體無交叉反應(yīng)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pET15b-Ezrin表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)、純化了Ezrin蛋白，經(jīng)鑒定純度較好。 第二章、胰腺癌血清中Ezrin抗原和自身抗體ELISA檢測(cè)方法的建立 目的：檢測(cè)Ezrin及自身抗體在胰腺

7、癌、胰腺炎、正常人血清中的水平是否存在差異。 方法：構(gòu)建單克隆抗體包板，多克隆抗體作為檢測(cè)抗體的雙抗體夾心ELISA方法，并用該方法同時(shí)對(duì)胰腺癌、胰腺炎、正常人血清中的Ezrin水平進(jìn)行檢測(cè)；以經(jīng)純化的原核重組表達(dá)的Ezrin蛋白作為抗原，建立間接ELISA的方法對(duì)胰腺癌、胰腺炎、正常人的血清標(biāo)本中的Ezrin自身抗體水平進(jìn)行檢測(cè)；通過對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，判斷Ezrin或其抗體是否是胰腺癌生物標(biāo)志物。 結(jié)果：建立了雙抗夾心

8、ELISA方法，用該方法檢測(cè)的11例胰腺癌、11例胰腺炎、12例正常人血清樣本的數(shù)據(jù)均較小，與空白相差不大，三組數(shù)據(jù)沒有顯著性差異（one-way ANOVA，P>0.05）；建立了檢測(cè)Ezrin自身抗體的間接ELISA方法，統(tǒng)計(jì)分析21例胰腺癌、21例胰腺炎、21例正常人的血清標(biāo)本檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)所有樣本都有陽性結(jié)果，而且數(shù)據(jù)沒有顯著性差異（one-way ANOVA，P>0.05）。 結(jié)論：Ezrin在血清中微量存在，但不是胰腺

9、癌特異的；另外，構(gòu)建的雙抗夾心ELISA方法沒有達(dá)到所需的靈敏度，在下一步的研究中，還需對(duì)檢測(cè)抗體進(jìn)行生物素標(biāo)記，放大信號(hào)；Ezrin抗體不是胰腺癌的特異標(biāo)志物，是自然存在的自身抗體（Naturally occurring auto-antibodies，NAbs），對(duì)機(jī)體有不可或缺的生理作用。 第三章、Pulldown結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)Ezrin相互作用蛋白 目的：采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選人胰腺癌細(xì)胞中與Ezrin蛋

10、白相互作用的蛋白。 方法：western-blot分析驗(yàn)證純化的Ezrin重組蛋白上含有His標(biāo)簽。裂解Panc-1細(xì)胞，獲得總蛋白提取液，采用Pull-down方法體外篩選與Ezrin重組蛋白相互作用的蛋白，并對(duì)篩選出的目的蛋白進(jìn)行雙向凝膠電泳和MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜鑒定，構(gòu)建交聯(lián)免疫沉淀方法，并用該方法對(duì)篩選的兩種蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果：雙向凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定結(jié)果共篩選出可與Ezrin重組蛋白相互作用的12

11、種蛋白，其分別為RNA-binding motif protein39（RBM39）、Transgelin（TAGLN）、Albumin（ALBU）、Formin-1（FMN1）、Rho GTPases（RHGBA）、Tetratricopeptide repeat protein16（TTC16）、Syntaxin-binding protein1（STXBP1）、N-acetylglucosamine-1-phosphate tra