滋陰清熱方對(duì)陰虛內(nèi)熱證SLE白細(xì)胞基因及蛋白表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)影響.pdf

1、研究背景: 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)作為一種嚴(yán)重危害健康的自身免疫性疾病，其病因、發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，治療至今仍是世界難題。目前西醫(yī)仍主要用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療，長期應(yīng)用會(huì)帶來明顯的毒副作用。臨床實(shí)踐證明中西醫(yī)結(jié)合治療SLE臨床療效突出，可減少藥物的毒副作用，提高SLE患者的生存質(zhì)量。陰虛內(nèi)熱是SLE的基本證型，滋陰清熱法是治療SLE基本法則?，F(xiàn)代研究認(rèn)為SLE的發(fā)生是由多基因共同作用的結(jié)果。研究sLE基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和蛋白

2、質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)變化將有助于我們對(duì)SLE發(fā)病的深入了解。 目的: 觀察滋陰清熱方治療陰虛內(nèi)熱證SLE的療效，研究SLE患者治療前、中(治療6周)、后(治療12周)外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)基因及蛋白表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)改變，了解陰虛內(nèi)熱證SLE患者基因及蛋白表達(dá)模式與正常人間的異同，從基因及蛋白水平探討中醫(yī)藥治療機(jī)理，為構(gòu)建中醫(yī)藥治療SLE的基因與蛋白表達(dá)譜

3、研究方法與平臺(tái)打下基礎(chǔ)。 方法: 1．研究對(duì)象 女性陰虛內(nèi)熱證SLE病例來自2005年11月至2006年11月在廣東省中醫(yī)院門診就診的確診病人，輕、中度活動(dòng)(5≤SLEDAI≥25分)，如使用了糖皮質(zhì)激素，則維持量為10～25 mg/日，三個(gè)月內(nèi)不加量，如使用過非甾體抗炎藥則需停藥一周以上，如使用過其它免疫抑制劑則需停藥半年以上。健康對(duì)照組來自于廣州中醫(yī)藥大學(xué)健康大學(xué)生和健康志愿者，共15例，均為女性。治療組總共

4、納入18例，其中退出2例，失訪1例，有效病例共15例，平均年齡：31.60±9.37；健康對(duì)照組平均年齡：28.4±6.50。兩組年齡經(jīng)兩樣本t檢驗(yàn)，方差齊性(P=0.098)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.289)。 2．治療與療效觀察 入選病例用滋陰清熱方制成膠囊，每次5粒，每日3次口服治療3個(gè)月，每兩周進(jìn)行中醫(yī)癥候積分評(píng)估，并在中藥治療前、治療6周、治療12周時(shí)評(píng)定活動(dòng)度積分，檢測患者血清補(bǔ)體C<,3>、C<,4>水平

5、、抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA抗體(Ds-DNA)、血常規(guī)、尿常規(guī)等指標(biāo)，提取PBMC總RNA和總蛋白質(zhì)，-70℃保存?zhèn)溆茫瑢⑼瓿?次觀察的合格病例的樣品進(jìn)行基因芯片與蛋白芯片的檢測。所有病例均按病例資料收集要求與規(guī)范詳細(xì)填寫《病例觀察報(bào)告表》。 3．基因芯片實(shí)驗(yàn)與分析方法 人類基因表達(dá)譜芯片由微芯生物公司采用cDNA直接點(diǎn)樣生產(chǎn)，共有8064個(gè)基因點(diǎn)，采用Cy3單熒光標(biāo)記探針，數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化校正，計(jì)算基因表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)

6、組和對(duì)照組間的比值(Ratio)，按Ratio大于2或小于0.5作為表達(dá)差異的顯著性標(biāo)準(zhǔn)。運(yùn)用國際通用的GeneCluster 2軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù)進(jìn)行SOMs(self-organizing maps；自組圖)分析、功能分類分析和聚類分析。 4．蛋白芯片實(shí)驗(yàn)與分析方法 采用表面加強(qiáng)激光解吸電離。飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI)方法建立SLE患者治療前、治療6周、治療12周以及正常對(duì)照組PBMC蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，利用浙江大學(xué)腫瘤

7、研究所余捷凱等研究設(shè)計(jì)的ZUCIPDAS軟件包找出蛋白質(zhì)荷峰，建立判別模型，采用基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)庫與Expasy蛋白數(shù)據(jù)庫交連比對(duì)分析方法初步確定蛋白質(zhì)荷峰的可能名稱與功能。 結(jié)果: 1．糖皮質(zhì)激素配合滋陰清熱方治療可以較快緩解陰虛內(nèi)熱證SLE患者病情，改善自覺癥狀，SLEDAI積分、中醫(yī)癥候積分治療后顯著下降，C<,3>、C<,4>水平上升，患者病情有明顯改善。中醫(yī)癥候積分與SLEDAI積分呈正相關(guān)，提示中醫(yī)癥候評(píng)分可

8、以較客觀地綜合反映患者的病情。 2．經(jīng)歸一化等數(shù)據(jù)處理后得到2946個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)。對(duì)其中至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)處理過程中存在明顯的表達(dá)差異的數(shù)據(jù)進(jìn)行自組圖分析分為25類共167個(gè)基因，3次表達(dá)經(jīng)重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，差異有顯著性意義(P=0.000)，其中有20個(gè)基因前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：其中人免疫球蛋白K鏈C區(qū)(IGKC)基因，治療后下調(diào)，低于正常人，其余19個(gè)基因(Arp2、ARCN1、CRY2、DAF、D

9、PYSL2、FMR1、FYN、GRO3、LFNG、IVNS1ABP、P125、PBEF、PRKCB1、PSCDBP、PTPRE、SCP2、TMEM2、TNF、ZFP103)盡管治療前與正常對(duì)照組比較正常、下調(diào)或上調(diào)各不相同，但治療后較治療前均表現(xiàn)為上調(diào)。 3．對(duì)87個(gè)前、中、后三次樣品具有相似性表達(dá)變化的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行了聚類分析，下調(diào)的有21個(gè)，上調(diào)的有66個(gè)。下調(diào)基因主要有免疫應(yīng)答相關(guān)基因(DXS1357E、LY117、IGHG

10、3、IGKC、IGL2、PTPRCAP)及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因(LY117、ADORA3、MIF、EDG6、CTSH)，以及一些細(xì)胞凋亡增殖、信號(hào)通道及代謝相關(guān)等基因(H2AFO、RPL28、FEZ1、EMP3、CAPN4、 MIF、DXS1357E、APRT、COX6A1、 PLEC1、RPS5、DGKA、NMBR、PTPRCAP)o上調(diào)的基因中主要有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(SHOC2、SEL1L、JAK2、NGB、BIG2、DPYSL2、RG

11、S19、PTGS2、BA13)，免疫炎癥相關(guān)基因(ILF3、B4-2、PTPRC、KLRC1、CSF2RB、PBEF、GRO3、DAF、SDCBP、TNF、TRA1、SSFA2、HSPA9B、JAK2)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控修飾相關(guān)基因(B4-2、ZNF9、RYBP、TFEC、ZNF217、SSX2、ATF3、HUMHOXY1、MAF、SMARCA5、LFNG、PTGS2、NS1-BP、EGR2、SF331、prpf4、6RSF1)，細(xì)胞增殖、凋亡

12、與分化相關(guān)基因(CLK1、BTG3、IFI16、 RYBP、TNF、CCNG2、 ERCC5、IDN3、CLK1、CDC23)，以及生物合成、膜蛋白等(TBCC、DLEU2、ZNF217、PLSCR1、TMEM2、SCP2、CD47、CGGBP1、TACC1、DNMl、EB12、PIGA、SLC7A6、KIAA1382、PTPRC、IPLA2、FOSB)。 4．研究發(fā)現(xiàn)陰虛內(nèi)熱證SLE患者治療前后均有凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)。治療

13、前促進(jìn)細(xì)胞凋亡的許多基因明顯上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡的基因則多數(shù)表達(dá)下調(diào)，而治療3個(gè)月后則出現(xiàn)相反的情況，證實(shí)細(xì)胞凋亡紊亂在SLE的發(fā)病中起著重要的作用，糖皮質(zhì)激素配合滋陰清熱方治療可能可以從凋亡的多個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控，從而改善病情。治療前后均下調(diào)，前后變化不大的有8個(gè)凋亡相關(guān)基因，其中抗凋亡的基因有：AIM、BLC2、BY55、HSPD1；促進(jìn)細(xì)胞凋亡的有：DR6、PA26；而HUSl與ITK在細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)節(jié)作用。治療后較治

14、療前上調(diào)的凋亡相關(guān)基因有21個(gè)，其中抗細(xì)胞凋亡的基因有：SGK、AD022、API5、BAG1、BAG3、BCL6、SGK、vCAM1、BCL2A1、BNIP2、GG2-1、HSPA1B、IL1B、TNFRSF6、IL2RB；促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因有：CASP3、TNF、TNFSF10，以及NKTR、HLA-DQA1、HLA-G、CD83參與體液免疫應(yīng)答和信號(hào)傳導(dǎo)等途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。 5．HLA基因家族等基因有異常表達(dá)：HLA-

15、C、HLA-DQB1、HLA-G與HLA-DPB1在SLE中以上調(diào)為主，雖然治療后表達(dá)有所下調(diào)，但總體仍高于正常人，而HLA-B、HLA-DQA1為下調(diào)，治療后無明顯改變，HLA-E治療后下調(diào)，但與治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.069)。HLA-DQB1基因可能是治療相關(guān)基因，治療后其對(duì)應(yīng)表達(dá)的HLA-DQB1蛋白片段量減少。 6．治療前陰虛內(nèi)熱證SLE患者與正常人蛋白表達(dá)存在差異：治療前SLE患者與正常人比較，找出152個(gè)蛋

16、白峰，其中73個(gè)峰差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，建立判別中藥治療前SLE患者與正常人的10542 Dam/z和2554 Dam/z蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測模型，其判別率為100％，可以通過以上兩個(gè)峰將SLE與正常人區(qū)別開來。10542標(biāo)志物最可能是HLA基因家族相關(guān)的多個(gè)蛋白片段的復(fù)合物。2554Dam/z可能與SLE的發(fā)病密切相關(guān)，可能是一個(gè)紅斑狼瘡患者發(fā)病有關(guān)的未知蛋白或多肽片段，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。 7．陰虛內(nèi)熱證SLE患者治療

17、前、后蛋白表達(dá)存在差異：治療3個(gè)月后與治療前比較，共發(fā)現(xiàn)蛋白峰167個(gè)，其中20個(gè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論: 1．治療后中醫(yī)癥候積分顯著低于治療前，滋陰清熱方可以改善SLE患者的陰虛內(nèi)熱癥狀。 2．陰虛內(nèi)熱證SLE患者細(xì)胞凋亡相關(guān)、免疫相關(guān)等基因表達(dá)紊亂，治療前、中、后許多基因表達(dá)有顯著改變，提示滋陰清熱方可能通過調(diào)節(jié)患者基因表達(dá)紊亂而達(dá)到陰平陽秘的治療作用。 3．陰虛內(nèi)熱證患者PBMC蛋