黃疸患者血清調(diào)節(jié)人PASMCs增殖及表型轉(zhuǎn)換作用的研究.pdf

1、肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是一種因肝臟受損引起遠(yuǎn)端器官肺發(fā)生嚴(yán)重病理改變的疾病,以“慢性肝病-肺微血管擴(kuò)張和增生-低氧血癥”為主要特征。在此病理過程中,慢性肝病產(chǎn)生大量的刺激因子(如細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子等),通過血液循環(huán)到達(dá)肺臟,作用于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs),導(dǎo)致肺內(nèi)微血管擴(kuò)張和增生,使肺部發(fā)

2、生氧合障礙出現(xiàn)低氧血癥。
　　目前,HPS的發(fā)病機(jī)制尚不明確。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)大鼠膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation, CBDL)后肺動脈管壁增厚導(dǎo)致了阻塞性肺血管病變,我們的前期研究發(fā)現(xiàn)CBDL大鼠血清可以促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)發(fā)生表型轉(zhuǎn)換和增殖。此外,大量研究表明PASMCs表型轉(zhuǎn)換和增殖是低氧性肺血管重建的核

3、心變化。這些結(jié)果提示低氧環(huán)境可能促進(jìn)HPS大鼠PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換和增殖,導(dǎo)致肺動脈管壁增厚,從而加重了肺部低氧血癥,促進(jìn)了HPS的發(fā)生發(fā)展。但是,在HPS患者中是否也發(fā)生PASMCs表型轉(zhuǎn)換和增殖,尚不清楚,值得進(jìn)一步研究。而黃疸多見于慢性肝病患者,鑒于此,我們推測:慢性肝病產(chǎn)生大量細(xì)胞因子、趨化因子及生長因子釋放入血,通過血液循環(huán)達(dá)到肺臟,作用于PASMCs引起了肺血管的病理性重建,導(dǎo)致了HPS的發(fā)生發(fā)展,這就是本課題立題的目的

4、。本課題通過原代培養(yǎng)成人PASMCs,觀察黃疸患者血清調(diào)節(jié)人PASMCs增殖及表型轉(zhuǎn)換的變化,同時,檢測肝硬化患者血清中細(xì)胞因子的變化情況,篩選出起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子,從而為HPS的防治提供新的靶點。
　　研究內(nèi)容:
　　1.應(yīng)用含適量的PDGF的高糖培養(yǎng)基原代培養(yǎng)成人PASMCs,運用光鏡、免疫熒光染色法進(jìn)行鑒定。
　　2.黃疸患者血清的收集,分別用正常和黃疸血清刺激人 PASMCs,用 CCK-8分別檢測其增殖情況

5、,Western blot檢測其calponin和α-SM-actin蛋白的變化情況。
　　3.應(yīng)用luminex-XMAP液相芯片檢測肝硬化患者血清中61種細(xì)胞因子的變化情況
　　研究結(jié)果:
　　1.應(yīng)用改良的成人 PASMCs培養(yǎng)方法進(jìn)行原代培養(yǎng),細(xì)胞在光鏡下呈梭形,細(xì)胞之間突起相互接觸,可見典型的“峰-谷”征象,細(xì)胞內(nèi)calponin和α-SM-actin蛋白經(jīng)免疫熒光染色鑒定均為陽性,說明了人PASMCs培養(yǎng)成

6、功。
　　2.黃疸患者血清促進(jìn)人 PASMCs的增殖。與正常血清刺激人 PASMCs比較,黃疸血清刺激人PASMCs的體外增殖能力明顯增強(qiáng)。在不同時間段內(nèi),48h內(nèi)的增殖能力最強(qiáng),雖然48h到72h增殖能力較弱,但仍比24h內(nèi)增殖能力強(qiáng)。說明了黃疸患者血清可以促進(jìn)人PASMCs在體外增殖。
　　3.黃疸患者血清促進(jìn)人PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)換作用24h后,western bolt檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常血清相比,黃疸血清刺激α-S

7、M-actin蛋白變化不明顯,而calponin蛋白卻表達(dá)升高。但是,隨著作用時間延長,48h和72h后,黃疸血清刺激α-SM-actin和calpnion蛋白的表達(dá)均明顯減少。
　　4.luminex-XMAP液相芯片檢測結(jié)果顯示61種細(xì)胞因子中,IL-6,IL-8,IL-15, IL-16,IL-23,TNF-α,IL-28A,LIF,I-309,IP10,MCP-4,6Ckine,BCA-1,MIP-1δ, INF-γ表達(dá)明

8、顯升高,而其他的細(xì)胞因子(如 IL-3、IL-7、TRAC、TRAIL、GRO、MCP-1、MCP-2、ENA-78及sCD40L)表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論:
　　1.改良的成人PASMCs培養(yǎng)方法克服了成人肺動脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)困難的問題,同時將人PASMCs應(yīng)用于實驗更符合人體形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特征。
　　2.黃疸患者血清促進(jìn)人PASMCs體外發(fā)生表型轉(zhuǎn)換和增殖。
　　3.通過luminex- XMAP液相芯片技術(shù)