人BCG特異性T細胞的表型、功能特征及其調節(jié)機制研究.pdf

1、結核(TB)目前仍然是危害人類生命健康的重大傳染病之一。據報道，全世界每年大約有800萬新增結核病人，同時大約有200萬人死于結核。此外，由于多重耐藥結核菌株的出現(xiàn)、HIV感染及卡介苗預防效果的不佳導致結核發(fā)病率逐年增加。雖然世界上有三分之一人口感染結核，但是TB的發(fā)病率只占感染者的5-10％，大約90％的人都處于隱性感染狀態(tài)，這說明機體能夠有效控制結核桿菌的生長繁殖。以往的研究表明，細胞免疫包括CD4、CD8和γδ T細胞等在結核防御

2、保護效應中發(fā)揮著十分重要的作用。動物實驗表明，去除CD4+T細胞的小鼠易于感染結核，而被動轉輸感染過TB小鼠的CD4+T細胞后又能重獲保護性免疫力。在人體有類似的證明，HIV感染的結核病人，隨著CD4+T數(shù)量的下降，其病情的嚴重性加重，同時，肺外結核、分枝桿菌菌血癥的發(fā)生率進行性增多，這充分證實了CD4+T細胞在結核免疫中的重要性。 卡介苗(BCG)是目前臨床上唯一應用于預防結核的疫苗。流行病學調查的結果表明，BCG除了對兒童播

3、散型結核的發(fā)生有一定的預防作用外，對成人結核和兒童肺結核無明顯的預防作用。因此，BCG免疫或結核菌感染后是否能誘導機體產生結核特異性效應和長期記憶性T細胞，這群細胞是否能發(fā)揮有效保護作用，仍是十分重要的科學問題。目前研究的結果表明，當初始CD4+T細胞活化后，可以分化為Th1、Th2和Th17細胞等不同功能亞群，這些亞群在抵御TB感染中的作用亦不同。分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α等細胞因子的Th1細胞主要介導胞內感染病原菌的免疫應

4、答，而且，產生不同細胞因子譜的細胞亞群所發(fā)揮效應功能及免疫記憶特性亦存在著差異。 當結核桿菌(MTB)進入機體后，機體將調動天然免疫(巨噬細胞、γδT細胞等)和獲得性免疫(Th1、CD8+T細胞等)多種機制殺傷清除MTB，抑制MTB擴散；與此同時，MTB也通過釋放某些抑制性蛋白或誘導機體細胞分泌抑制性因子或誘導抑制性細胞(調節(jié)性T細胞，Treg)的生成，間接或直接地抑制機體的免疫應答，甚至使免疫細胞功能失活，達到逃避免疫攻擊，致

5、使MTB在機體內存活和繁殖的目的。為此，一方面，人們期望尋找機體TB特異性免疫應答，尤其是控制MTB相關的細胞亞群；另一方面，期望阻斷MTB逃逸免疫的過程以逆轉MTB誘導宿主的免疫抑制狀態(tài)，從而誘導抗TB免疫應答反應，防治TB。 本研究的目的在于： 1)探討B(tài)CG免疫或結核菌感染后是否能誘導機體產生BCG特異性效應/記憶T細胞； 2)結核特異性效應/記憶T細胞的亞群(CD4、CD8、γδT細胞)、表型特征及功能；

6、 3)結核抗原特異性效應/記憶細胞的調控因素及其機制； 4)結核病人病灶局部抗原特異性T細胞的表型和功能特點。 為了實現(xiàn)上述目標，該論文進行了較為系統(tǒng)的研究，結果分為以下四個部分： 第一部分：PPD+者或結核隱性感染者PBMCs中存在BCG特異性記憶性Th1細胞，這些細胞受到調節(jié)性T細胞的調控。 本實驗以PPD+者或隱性感染者以及活動性結核病人為研究對象，檢測其BCG特異性T細胞免疫應答特征，探討

7、了Treg細胞對其免疫應答的抑制作用及其機制。結果表明，PPD+正常人PBMCs經BCG刺激后可誘導IFN—γ的產生，且主要是CD4+而非CD8+T細胞。IFN—γ+CD4+T細胞主要為記憶細胞，包括中央型和效應型記憶細胞。為了進一步探討Treg細胞是否調控BCG特異性效應/記憶Th1細胞的免疫應答，本研究又檢測了結核病人外周血Treg細胞的數(shù)量、表型、功能特征及其調節(jié)機制。結果表明，CD4+CD25highFoxp3+和CD4+CD2

8、5highCTLA—4+細胞比例在結核病人顯著地高于正常人，該細胞的表型特征為CD45RA—CD45RO+CD62Lhigh，表達HLA—DR和GITR水平高于CD4+CD25-和CD4+CD25low細胞，而且能夠抑制BCG特異性效應細胞分泌IFN—γ，而加入抗IL-10中和抗體后能逆轉這種抑制作用，提示免疫調節(jié)因素在結核的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。 第二部分：BCG特異性多功能效應/記憶性T細胞的表型、功能特征及其調節(jié)。

9、在第一部分試驗中，我們證明了PPD+者外周血中存在著BCG特異性記憶Th1細胞，這些細胞受控于Treg細胞。本實驗進一步檢測了BCG是否能誘導其它Th1細胞因子的產生。結果表明，除了IFN—γ之外，CD4+T細胞還分泌IL—2和TNF—α。依據分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α三種細胞因子的不同組合，BCG特異性Th1細胞至少可以分為七個亞群，其中單陽性細胞所占比例最高，且細胞因子的熒光強度在不同亞群也存在差異。以往多數(shù)研究在檢測結核

10、特異性T細胞功能時，均以細胞因子分泌作為評價指標，這并不能完全反映T細胞的功能。在本實驗中，我們也發(fā)現(xiàn)，無論PPD+正常人或結核病人，BCG只能誘導CD4+而非CD8+T細胞產生細胞因子。然而，在相同培養(yǎng)條件下，CD4+和CD8+T細胞均會發(fā)生活化、分裂、增殖。表型分析表明，增殖的CD4+T細胞為CD25+CD45RA—CCR7-CD62L+，而CD8+T細胞為 CD25+CD45RA+/—CCR7+CD62Lhigh，表明這些CD4+

11、T或CD8+T細胞為效應型或中央型記憶細胞。在多克隆刺激劑刺激后，這些BCG特異性增殖的CD4+和CD8+T細胞能夠分泌Th1細胞因子，并且，特異性增殖的CD8+T細胞表達顆粒酶B。此外，我們發(fā)現(xiàn)Treg細胞能夠抑制BCG特異性誘導的CD4+和CD8+T細胞增殖及IFN—γ分泌，這種抑制作用可部分被IL-10中和抗體所逆轉。因此，本實驗通過對于活化、分裂、增殖等生物學功能的檢測，證明了PPD+正常人及結核病人PBMCs中存在功能性效應型

12、/中央型記憶性CD4+和CD8+T細胞，并受到Treg的調控。 第三部分：結核菌抗原(ESAT—6)特異性記憶性γδ T細胞的表型、功能分析及其調節(jié)。 除了觀察對BCG的反應性之外，本實驗檢測了PPD陽性正常人對于結核抗原ESAT—6的反應性，ESAT—6能顯著增加IFN—γ產生的量和IFN—γ陽性細胞頻數(shù)。且IFN—γ主要是由γδ T細胞而非CD4、CD8和NK細胞所分泌。此外，抗原特異性γδT細胞還分泌TNF—α，但

13、不表達IL—2。該細胞表達CD45RO而不表達CD45RA，且臍帶血單個核細胞對ESAT—6無應答，表明該抗原特異性γδ T細胞為記憶性T細胞。純化的γδ T細胞能夠對EAST—6發(fā)生應答，即不依賴于抗原提呈的作用。為進一步驗證γδ T細胞應答是否需要CD4+T細胞的輔助，純化出CD4+T細胞，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞不僅未能增加γδT細胞的IFN—γ產生，反而抑制了IFN—γ的產生，據此推論可能為Treg細胞的作用。因此，分別分離CD4+C

14、D25+、CD4+CD25-和γδ T細胞，結果表明，Treg細胞而非CD4+CD25-細胞能夠抑制γδ T細胞IFN—γ的產生，且能夠被抗IL-10的中和抗體逆轉，說明CD4+CD25+細胞部分通過可溶性細胞因子發(fā)揮對γδ T細胞的抑制作用。 第四部分：結核菌病灶部位(結核性胸膜炎病人胸水中)BCG特異性記憶性T細胞的表型和功能特征。 由于結核發(fā)病部位的局限性，病灶局部免疫應答對于研究結核病的免疫狀態(tài)具有十分重要的意義

15、，因此，本部分內容對于結核性胸膜炎病人胸水BCG特異性T細胞進行了分析。結果表明，BCG刺激后能夠誘導CD4+T細胞分泌IFN—γ、IL—2和TNF—α，且比例顯著高于結核病人PBMCs。依據上述三種細胞因子的分泌與否可以將Th1細胞分為七個不同亞群，單陽性細胞亞群所占比例最高，其次為雙陽性細胞亞群，最后為三陽性細胞。進一步分析各細胞亞群細胞因子表達的熒光強度，結果表明，按細胞因子產生數(shù)量的多少，(3+)>(2+)>(1+)的細胞亞群，

16、各亞群中同種細胞因子表達的熒光強度呈下降趨勢，即在單個細胞水平上進行比較時，(3+)細胞亞群不僅產生細胞因子的種類多，且產生細胞因子的量也遠遠高于細胞因子單陽性和雙陽性細胞亞群。表型分析表明BCG特異性IFN—γ+細胞為效應型或中央型記憶細胞。 本研究的結論和創(chuàng)新之處： 1、PPD+正常人及結核病人PBMCs中存在BCG特異性多功能記憶CD4+T細胞； 2、BCG特異性記憶CD8+T細胞可以發(fā)生活化、分裂、增殖；

17、 3、Treg細胞抑制BCG特異性記憶性CD4+和CD8+T細胞增殖及細胞因子分泌； 4、PPD+正常人PBMCs中存在結核菌特異性記憶性γδ T細胞，且受到Treg細胞的調控； 5、結核性胸膜炎病人胸水存在BCG特異性多功能性記憶性CD4+T細胞，但單陽性細胞亞群所占比例最高。 該研究將為深入了解疫苗免疫或結核菌感染后結核抗原特異性T細胞的表型和功能特征、結核應答的調控因素、結核桿菌逃逸機體免疫監(jiān)視的機