肝肺綜合征患者血清調節(jié)人LFs肌樣分化及增殖、遷移作用的研究.pdf

1、肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是慢性肝病患者所發(fā)生的肺部并發(fā)癥，常伴隨有門肺高壓和肺內血管擴張導致的嚴重低氧血癥。肺微血管擴張和再生所導致的氣體交換異常是HPS特征性的病理生理改變。HPS常見于肝硬化患者終末期，目前常用動脈血氣、增強對比超聲心動圖、肺灌注掃描和肺血管造影來確診是否HPS患者肺部存在特征性的肺血管異常。臨床上除肝移植外，現無有效治療肝肺綜合征的方法，因此其嚴重影響患者的生存質量和導

2、致高死亡率。前期研究發(fā)現:肺血管重建(pulmonary vascular remodeling，PVR)可能是其主要發(fā)病機制之一。其病理生理進程是一個由多種細胞共同參與、相互影響的復雜網絡共同作用的結果，非肌性血管部位出現平滑肌樣細胞、肌性血管中膜和外膜增厚、內膜斑塊形成，致使肺PVR發(fā)生;肺動脈平滑肌大量增殖，并從血管中層遷移至血管內膜，使整個肺微血管擴張和重建。
　　肌成纖維細胞(Myofibroblast，MF)是成纖維細

3、胞的特殊分化類型，其超微結構特征介于成纖維細胞和PASMCs之間，是屬于PASMCs樣細胞中的一種。既往研究認為PASMCs從中膜遷移到內膜大量增殖，其細胞表型也由高分化的收縮型轉換為未分化的合成型，PVR的病理變化是血管內膜PASMCs大量堆積所致。然而越來越多的研究發(fā)現外膜成纖維細胞、成纖維母細胞在低氧等刺激因素作用下，活化形成MFs，因此我們推測活化的MFs可能遷移至內膜并大量增殖，直接參與PVR內膜大量堆積PASMCs的形成。但

4、是，具體的機制尚不清楚。前期已經做了關于肝肺綜合征患血清對SD大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖、遷移及表型轉換的影響的相關研究，其結果是肝肺綜合征患者血清可促進PASMCs向合成表型的轉換，并增強其增殖、遷移能力。由此推測:HPS血清中的細胞因子釋放，進入血液循環(huán)后達到肺臟，刺激血管外膜LFs(Lungfibroblast.LFs)，使LFs增殖遷移和發(fā)生肌樣分化，最終導致肺血管的病理性重建和HPS的發(fā)生發(fā)展。本課題通過體外培養(yǎng)

5、成人LFs，模擬生理條件下HPS患者血清對人LFs肌樣分化，增殖及遷移變化的影響，探索LFs在HPS患者血管重建中所起到的作用，從而為HPS的防治提供新的靶點。
　　研究內容:
　　1、培養(yǎng)及鑒定人肺原代LFs，原代LFs培養(yǎng)3-4天后傳代，運用光鏡、免疫熒光染色法進行鑒定。
　　2、肝肺綜合征患者血清的收集，按照入選標準篩選合格的HPS患者與健康對照組，并且按要求抽取少量外周血液提取血清。
　　3、分別用正常和

6、肝肺綜合征患者血清刺激人LFs，免疫組化檢測細胞SM-α-actin的表達情況。
　　4、分別用正常和肝肺綜合征患者血清刺激人LFs，Western blot檢測其SM-MHC和SM-α-actin蛋白的變化情況。
　　5、分別用正常和肝肺綜合征患者血清刺激人LFs，用3H-TdR和transwell法檢測各組LFs的增殖和遷移能力。
　　研究結果:
　　1、在倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的人LFs，細胞呈長梭形和針

7、狀形態(tài)為主，貼壁生長，細胞間界限清楚，立體折光率高，彼此間連接成網狀。通過波形蛋白vimentin免疫熒光染色鑒定為LFs。
　　2、肝肺綜合征患者血清的收集，-80度凍存待用。
　　3、免疫組化法結果，與正常血清處理組比較，肝肺綜合征患者血清組培養(yǎng)細胞呈長梭形，核呈桿狀或橢圓狀，細胞胞漿有大量棕黃色顆粒沉積。正常者的血清刺激細胞在倒置顯微鏡下單層貼壁生長，狀如梭形或三角形，胞核清晰，胞漿豐富，SM-α-actin免疫化學染

8、色胞內未見明顯的棕黃色沉淀。
　　4、western bolt檢測顯示:實驗組SM-α-actin、SM-MHC蛋白表達上調，尤其在48h(T2)和72h(T3)時間點，肝肺綜合征血清刺激SM-α-actin、SM-MHC蛋白表達明顯增加，呈時間依賴的遞增趨勢(P＜0.05)，而正常血清組無明顯變化。
　　5、3H-TdR檢測和transwell檢測，與對照組相比，體外實驗中，HPS血清使人肺2代LF的遷移、增殖能力增強，尤