周細(xì)胞凋亡在肝肺綜合征肺微血管擴(kuò)張中的作用研究.pdf

1、背景和目的:
　　肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome, HPS)是以肝病或門脈高壓為基礎(chǔ)形成的一種以肺微血管擴(kuò)張和低氧血癥為主要特征的嚴(yán)重血管并發(fā)癥。HPS一旦發(fā)生,肝病患者的死亡率顯著增加。肺微血管擴(kuò)張是HPS最主要的病理變化。周細(xì)胞位于微血管壁外側(cè),其細(xì)胞突觸呈放射狀,沿著血管長軸方向分布,這些突觸與多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞表面連接,像“爪子”一樣牢固的盤踞在微血管壁上,這些特點(diǎn)使周細(xì)胞具有調(diào)節(jié)微血管管徑的結(jié)構(gòu)基

2、礎(chǔ);此外,周細(xì)胞還表達(dá)豐富的與細(xì)胞收縮相關(guān)的蛋白和蛋白激酶,這些特性使周細(xì)胞具有調(diào)節(jié)微血管管徑的功能基礎(chǔ)。近年部分研究發(fā)現(xiàn)caspase-3激活是周細(xì)胞減少的重要調(diào)節(jié)信號(hào),而周細(xì)胞的減少又與某些病理性血管擴(kuò)張有關(guān)。但是,肺周細(xì)胞減少是否與HPS肺微血管擴(kuò)張相關(guān),尚不清楚。膽總管結(jié)扎(common bile duct ligation, CBDL)模型是目前國內(nèi)外公認(rèn)的HPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。本研究通過培養(yǎng)肺周細(xì)胞,觀察CBDL大鼠血清對(duì)肺周細(xì)胞

3、凋亡和caspase-3表達(dá)的影響;觀察CBDL大鼠肺細(xì)胞凋亡、caspase-3表達(dá)情況和周細(xì)胞的主要標(biāo)志蛋白α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、神經(jīng)元膠質(zhì)抗原2(neuron-glial antigen2, NG2)、desmin的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化;抑制 caspase-3后檢測肺細(xì)胞凋亡,α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化,以及肺微血管擴(kuò)張和血氧交換

4、情況,證明如下假設(shè):CBDL產(chǎn)生的血清因子變化,通過血液循環(huán)作用于肺微血管,致caspase-3激活,肺周細(xì)胞凋亡,進(jìn)而引起肺微血管擴(kuò)張、血氧交換異常和低氧血癥,最終揭示肺周細(xì)胞凋亡在HPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头挝⒀軘U(kuò)張中的重要作用。
　　方法:
　　1. CBDL大鼠血清對(duì)肺周細(xì)胞凋亡的作用研究
　　1.1.肺周細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定。
　　1.2.采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型,收集CBDL1wk血清。
　　1.3.

5、CBDL大鼠血清培養(yǎng)肺周細(xì)胞后,分別用TUNEL和western blot檢測其凋亡和caspase-3表達(dá)情況。
　　2. CBDL大鼠中肺周細(xì)胞的變化研究
　　2.1.采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型。
　　2.2.分別用TUNEL和western blot檢測CBDL大鼠肺細(xì)胞的凋亡和caspase-3的表達(dá)。
　　2.3.分別用western blot和免疫組化法檢測CBDL大鼠肺α-SMA、desmin

6、、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化。
　　3.抑制caspase-3對(duì)CBDL大鼠肺周細(xì)胞的影響及HPS的作用研究
　　3.1.采用CBDL法構(gòu)建HPS大鼠模型,手術(shù)后第一天起每天給模型大鼠腹腔注射caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK,連續(xù)2wk。
　　3.2.用TUNEL法檢測抑制caspase-3后CBDL大鼠肺細(xì)胞的凋亡情況。
　　3.3.分別用 western blot和免疫組化法檢測抑制 c

7、aspase-3后 CBDL大鼠肺α-SMA、desmin、NG2的蛋白水平及其陽性細(xì)胞率的變化。
　　3.4分別用血?dú)夥治龊虷E染色法觀察抑制caspase-3后CBDL大鼠血氧交換和肺微血管擴(kuò)張情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功培養(yǎng)出高純度的肺周細(xì)胞:倒置顯微鏡下見培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭型或星芒狀,單核,偶見雙核,核卵圓形,有細(xì)胞突起,漩渦或柵欄狀生長,無接觸性抑制;經(jīng)α-SMA、desmin和NG2免疫熒光染色測定為陽性,

8、CD31染色為陰性。
　　2. CBDL大鼠血清促進(jìn)肺周細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞的增加和caspase-3的表達(dá)。
　　3. CBDL后肺 TUNEL陽性細(xì)胞和 caspase-3表達(dá)顯著增加然后逐漸降低,其中CBDL1wk時(shí)為最高值,α-SMA、desmin、NG2的表達(dá)水平及其陽性細(xì)胞率顯著減少。
　　4.早期使用 caspase-3抑制劑 Z-DEVD-FMK顯著降低了 CBDL大鼠肺 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量,抑

9、制了α-SMA、desmin、NG2的表達(dá)水平及其陽性細(xì)胞率的下降,減輕了肺微血管擴(kuò)張,改善了血氧交換。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立了一套簡單有效的肺周細(xì)胞培養(yǎng)方法。
　　2. CBDL引起的血清變化促進(jìn)了肺周細(xì)胞凋亡。
　　3. Caspase-3激活導(dǎo)致肺周細(xì)胞凋亡可能是CBDL大鼠肺α-SMA、desmin和NG2表達(dá)水平及其陽性細(xì)胞率下降的原因。
　　4.早期使用caspase-3抑制劑Z-DEV