土茯苓中落新婦苷的提取純化及抗腎纖維化作用的研究.pdf

1、土茯苓是百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖，是臨床上常用的傳統(tǒng)中藥材，含有多種活性成分。落新婦苷是土茯苓中含量最高的黃酮類成分，具有抗炎及抗氧化等作用。本論文研究了一種適合工業(yè)化生產(chǎn)的落新婦苷制備方法，通過結(jié)構(gòu)鑒定確定為一水合落新婦苷，并對其對抗腎纖維化作用進行了的研究，主要內(nèi)容包括以下幾個部分：
　?。?）以落新婦苷為考察指標(biāo)采用HPLC法對土茯苓的藥材產(chǎn)地進行了篩選，確定藥材產(chǎn)地為越南，建立了越

2、南產(chǎn)土茯苓藥材的HPLC特征圖譜，為土茯苓的藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)。土茯苓藥材特征圖譜中應(yīng)有8個特征峰，與參照物相對應(yīng)的峰為S峰，各特征峰與S峰的相對保留時間規(guī)定值為：0.54（峰1）、0、93（峰2）、1.18（峰3）、1.20（峰4）、1.26（峰5）、1.33（峰6）、1.62（峰7）。各個峰的相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5％之內(nèi)，其中峰5的相對峰面積為19.85％。
　?。?）以越南產(chǎn)的土茯苓為研究對象，通過L9(34)正交試

3、驗優(yōu)化了落新婦苷的提取方法，采用大孔樹脂柱層析的方法研究了落新婦苷的分離純化工藝，最后確定落新婦苷的制備工藝為：土茯苓藥材飲片加60%乙醇溶液20倍浸泡提取2次，每次12小時，合并提取液，濃縮脫醇，加樣于AB-8型大孔樹脂柱，先用10%乙醇洗脫去除雜質(zhì)，再用40%乙醇洗脫落新婦苷，收集40%乙醇洗脫液部分，回收乙醇，濃縮，冷藏結(jié)晶，過濾，重結(jié)晶，干燥得到落新婦粗品，將落新婦苷粗品用10%乙醇溶解，再用AB-8大孔樹脂吸附，先用15%乙醇

4、洗滌，再用25%乙醇洗脫，收集25%乙醇洗脫液，濃縮至適當(dāng)濃度，冷藏結(jié)晶，過濾，重結(jié)晶，減壓干燥，得到落新婦苷樣品，含量在95%以上。經(jīng)過中試驗證，該工藝操作簡便、穩(wěn)定可控，而且不使用有機溶劑，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
　　（3）落新婦苷樣品經(jīng)過進一步柱層析純化處理純度達到99.8%，采用紅外吸收光譜（IR）、紫外吸收光譜（UV）、1H-NMR、13C-NMR、二維NMR、1H-13C偶合譜（HSQC）和1H-13C遠程偶合譜（HMBC）

5、等手段確認了落新婦苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并通過高分辨質(zhì)譜、元素分析、熱分析和圓二色散證明了落新婦苷中含有一分子結(jié)晶水。
　?。?）通過建立不同的大鼠腎病模型，研究了落新婦苷的抗腎纖維化作用。首先選擇了結(jié)晶沉積致大鼠慢性腎功能衰竭模型和殘腎過度使用致大鼠腎功能衰竭模型；超過40%的糖尿病腎病患者會發(fā)展至終末期，因此也建立了糖尿病腎病模型，并與降糖藥聯(lián)合應(yīng)用。將動物的高死亡率作為發(fā)展到終末期的重要標(biāo)志，研究顯示落新婦苷長期給藥能夠顯著的降低動

6、物死亡率。血清肌酐和尿素氮水平是臨床上檢測腎功能的重要指標(biāo)，尿蛋白的排出量是臨床檢測糖尿病腎病和向終末期發(fā)展的重要標(biāo)志，研究顯示落新婦苷長期給藥能夠持續(xù)抑制血清肌酐、尿素氮、尿蛋白水平的升高。
　　實驗證明，落新婦苷能明顯降低腎臟纖維化大鼠尿素氮、肌酐水平、尿蛋白排泄量、尿量及腎肌酐清除率；顯著提高大鼠的存活率；改善腎小管間質(zhì)病理變化；降低TGF-β1和CTGF的表達，而且CTGF的減少和落新婦苷呈劑量關(guān)系，推測落新婦苷抗腎纖維化